Nous remercions Sergei Demin et Tatyana Karamysheva pour leur aide dans la préparation des chromosomes et FISH sur Anopheles. Nous remercions également David Severson de nous donner Aedes et Culex ADN génomique des clones BAC et Melissa Wade pour éditer le texte. Ce travail a été soutenu par deux subventions du National Institutes of Health: 1R21 AI88035-01 à Maria V. Sharakhova et AI094289 1R21-01 à Igor V. Sharakhov.

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	<li>Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V., Verrity, J. F., Abbington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome Mapping Research Developments. , (2008).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly.">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome biology. 8, R5 (2007).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs--a+new+source+of+chromosomes+for+genome+mapping+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti.">Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS neglected tropical diseases. 5, e1335 (2011).</li><li>Brown, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+physical+map+of+Aedes+aegypti.">Toward a physical map of Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 4, 161-167 (1995).</li><li>Steiniger, G. E., Mukherjee, A. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Non fluorescent hybridation in situ sur chromosomes mitotiques de moustiques a été réalisée pour la première fois en 1990 par A. Kumar et K. Rai 17. Dans cette étude, 18S et 28S des gènes d&#39;ADN ribosomal, cloné dans un plasmide ensemble, ont été placés sur les chromosomes de 20 espèces de moustiques. La sonde d&#39;ADN a été marqué radioactivement et hybridés aux chromosomes de ganglions du cerveau. Parmi les trois genres de moustiques, une technique FISH a été développé uniquement pour les chromosomes mitotiques de la lignée cellulaire d&#39;Ae. aegypti 10,18,19 et n&#39;a jamais été effectuée sur les chromosomes mitotiques de moustiques vivants. Récemment, nous avons développé une technique simple et robuste pour l&#39;obtention des préparations chromosomiques de haute qualité des ID des 4 e stade larvaire 9. Cette méthode permet à un nombre élevé de chromosomes à obtenir dans une diapositive et peut être utilisé universellement pour toutes les espèces de moustiques. La nécessité d&#39;utiliser sta seule larve, nymphe ou adulte neges de moustiques, pour la préparation des lames est probablement la seule limite de la méthode. La méthode FISH standard de 12 a été optimisé pour l&#39;utilisation de la génomique clone BAC et l&#39;IGS ADNr comme sondes pour les chromosomes mitotiques de Aedes, Culex, Anopheles et. En plus de ces applications spécifiques, les protocoles FISH décrites ici peuvent également être utilisés à d&#39;autres fins. Le protocole FISH avancé, qui utilise C 0 t fractions d&#39;ADN pour bloquer l&#39;hybridation non spécifique, peut également être appliquée pour l&#39;hybridation de clones BAC ou d&#39;autres fragments d&#39;ADN grandes régions hétérochromatiques d&#39;Anopheles. Régions hétérochromatiques sont enrichis en éléments transposables et répète autres, et les sondes de ces régions produisent normalement solide expérience sur les 3 chromosomes. Utilisation non marquées C 0 fractions d&#39;ADN t aidera à réduire l&#39;hybridation non spécifique de la sonde aux chromosomes. La version simple de la pr POISSONotocole peut être utilisé pour n&#39;importe quel ADNr ou des sondes d&#39;ADN répétitives sur les chromosomes mitotiques de moustiques et d&#39;autres insectes. En outre, il peut également être appliquée pour l&#39;hybridation de l&#39;ADN clone BAC en espèces à faible teneur en ADN répétitif dans les régions euchromatiques comme Anopheles ou la drosophile. Le protocole proposé ici permettra d&#39;obtenir très-finis assemblées du génome chromosomique base pour les moustiques et peut être largement utilisé pour des applications cytogénétiques différents autres groupes d&#39;insectes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope Leica MZ6 </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Un stéréomicroscope différente peut être utilisée </td></tr><tr><td> Microscope Olympus CX41 phase de </td><td> Olympe </td><td> CX41 </td><td> Un microscope de phase différent peut être utilisé </td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscope à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> BX61 </td><td> Un microscope fluorescent différent peut être utilisé </td></tr><tr><td> Faites glisser ThermoBrite dénaturation / hybridation système </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Sert de bloc de chauffage et une chambre humide </td></tr><tr><td> Aiguilles à dissection </td><td> ScienceTools Beaux- </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Porte-aiguilles </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 à double dépoli micro glisse </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 lamelles de microscope mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Rubber Cement </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool 200 Proof </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide propionique </td><td> Sigma-ALDRich </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Acide chlorhydrique </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Citrate de sodium dihydraté </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Trihydrate d&#39;acétate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% FBN (formol tamponné neutre) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Sel de sodium de sulfate de dextrane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x tampon SSC </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM YOYO-1 d&#39;iodure (491/509) solution </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez Antifade réactif de Gold </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> ADN polymérase I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 nucléase </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> ADN de sperme de saumon </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> US Biological </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Sang Qiagen et Maxikit culture cellulaire </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Qiagen construire de grands </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes

Hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique couramment utilisée par de nombreux laboratoires pour déterminer la position chromosomique de sondes d&#39;ADN et d&#39;ARN. Une application importante de cette méthode est le développement de la haute qualité des cartes physiques utiles pour améliorer les assemblages génome pour divers organismes. La tendance naturelle des bandes des chromosomes polytènes et mitotique fournit des indications pour la commande précise et l&#39;orientation des supercontigs génomiques. Parmi les trois genres de moustiques anophèles, à savoir, Aedes, et Culex, une technique bien établie basée sur la cartographie de chromosomes a été développé uniquement pour les Anopheles, dont les membres possèdent des chromosomes polytènes lisibles 1. En raison de travaux de cartographie du génome, 88% de l&#39;An. gambiae génome a été placé à des postes précis du chromosome 2,3. Deux genres de moustiques du genre Aedes, autres et Culex, ont mal polytenized b chromosomesarce que la surreprésentation significative des éléments transposables dans leurs génomes 4, 5, 6. Seulement 31 et 9% des supercontings génomiques ont été attribués sans ordre ou l&#39;orientation des chromosomes de Ae. aegypti 7 et Cx. quinquefasciatus 8, respectivement. Préparation des chromosomes mitotiques pour ces deux espèces avaient déjà été limitée aux ganglions du cerveau et des lignées cellulaires. Toutefois, des lames de chromosomes préparés à partir des ganglions du cerveau de moustiques contiennent généralement un faible nombre de plaques métaphasiques 9. En outre, même si une technique FISH a été développé pour les chromosomes mitotiques provenant d&#39;une lignée cellulaire d&#39;Ae. aegypti 10, l&#39;accumulation de multiples réarrangements chromosomiques dans les chromosomes de lignées cellulaires 11 rend inutiles pour la cartographie du génome. Nous décrivons ici une technique simple et robuste pour obtenir de haute qualité des préparations de chromosomes mitotiques de disques imaginaux (ID) de 4 e stade larvaire qui cPeut être utilisé pour les trois genres de moustiques. Un protocole standard de 12 FISH est optimisé pour l&#39;utilisation de clones BAC de l&#39;ADN génomique comme une sonde sur les chromosomes mitotiques de Ae. aegypti et Culex. quinquefasciatus, et d&#39;utiliser un espaceur intergénique (IGS) de l&#39;ADN ribosomique (ADNr) comme sonde sur un. chromosomes gambiae. Outre la cartographie physique, la technique développée peut être appliquée à la cytogénétique populations et la taxonomie des chromosomes / systématique de moustiques ou d&#39;autres insectes et les groupes.

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Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Parmi les trois genres de moustiques, à savoir<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, Et<em&gt; Culex</em&gt;, Physiques techniques de cartographie du génome ont été mis en place uniquement pour les<em&gt; Anopheles</em&gt;, Dont les membres possèdent des chromosomes polytènes lisibles. Pour les genres de<em&gt; Aedes</em&gt; Et<em&gt; Culex</em&gt; Cependant, la cartographie cytogénétique reste difficile en raison de la mauvaise qualité des chromosomes polytènes. Nous présentons ici un protocole universel pour obtenir de haute qualité des préparations de chromosomes mitotiques et un protocole FISH optimisé pour les trois genres de moustiques.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

25.5K vues.  Virginia Tech. Parmi les trois genres de moustiques, à savoir Anopheles, Aedes, Et Culex, Physiques techniques de cartographie du génome ont été mis en place uniquement pour les Anopheles, Dont les membres possèdent des chromosomes polytènes lisibles. Pour les genres de Aedes Et Culex Cependant, la cartographie cytogénétique reste difficile en raison de la mauvaise qualité des chromosomes ...