Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace, combinez 10 microlitres d’extrait acellulaire avec quatre microgrammes d’ADN plasmidique et 25 microlitres de tampon de synthèse de protéines acellulaires 2X. Préparez jusqu’à un volume total de 50 microlitres avec de l’eau doublement distillée pour préparer la solution de synthèse de protéines acellulaires. Pesez 0,75 gramme d’agarose et ajoutez-le à 100 millilitres de tampon d’eau doublement distillée pour préparer 0,75 % d’agarose.
Passez l’agarose à 0,75 % au micro-ondes par rafales de 30 secondes à haute puissance et pipetez 50 microlitres d’agarose fondue dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre ou dans des moules de la forme souhaitée. Placez l’agarose fondue sur un bloc chauffant réglé à 50 degrés Celsius et laissez l’agarose refroidir mais pas polymériser. Ensuite, mélangez l’agarose fondue avec la solution de synthèse protéique acellulaire en pipetant et en agitant avec la pointe de la pipette.
Laissez les gels refroidir à température ambiante et polymérisez pendant environ deux minutes. Transférez l’agarose polymérisée dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide d’une spatule et congelez rapidement dans de l’azote liquide. Placez les hydrogels surgelés dans un stockage à moins 80 degrés Celsius pendant une heure.
Après cela, retirez les couvercles des tubes de la microcentrifugeuse. Couvrez les tubes d’un film de cire et percez le film pour permettre à l’humidité d’être séchée. Réglez la température du lyophilisateur à moins 20 degrés Celsius et la pression à 0,1 millibar et lyophilisez les appareils de synthèse de protéines acellulaires pendant 18 heures ou toute la nuit.
Réhydratez les appareils lyophilisés pendant 30 minutes avec 50 microlitres d’eau doublement distillée sans excès de liquide, et transférez les gels sur une plaque de microtitration noire à 384 puits à l’aide d’une spatule. Enfin, placez la plaque de microtitration sur un lecteur de plaques et utilisez les paramètres du lecteur de plaques affichés à l’écran pour la détection et l’analyse de la fluorescence. La synthèse protéique acellulaire de l’eGFP et de mCherry dans un hydrogel à l’aide de lysats cellulaires d’E. coli est illustrée sur cette figure.
Des gels d’agarose à 0,75 % ont été préparés sans matrice d’ADN avec quatre microgrammes de matrice eGFP ou mCherry ou avec quatre microgrammes de matrice eGFP et mCherry. Une superposition des deux canaux est également affichée, et la superposition inclut l’image de contraste d’interférence différentielle. Les résultats ont confirmé la co-expression de mCherry et d’eGFP dans l’agarose.
