Les auteurs tiennent à remercier le Dr David Tirrell (Caltech) pour son aimable don du plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, le Dr Tom Muir (Université de Princeton) pour son aimable don du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japon) pour son aimable don du plasmide PET30-ACTU-Astuce1 10, et le Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) pour son aimable don du plasmide pJD757 13 . Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation CARRIÈRE, US Air Force PIJ et de recherche avancée Hackman Norman.

Une. Construction des plasmides REMARQUE: Tous les gènes ont été amplifiés dans des réactions de PCR standard utilisant Phusion haute fidélité ADN polymérase selon les spécifications du fabricant. Les amorces utilisées pour le clonage ont été décrits précédemment 9. Toutes les constructions sont énumérés dans le tableau 1. <ol><li> Pour générer ACTU-NpuN (N, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR des gènes de l&#39;ACTU et NpuN de plasmides PET30-ACTU-Astuce1 10 et KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectivement, en utilisant les amorces appropriées. </li><li> Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine tag C-terminal pour générer N (figure 2A). </li></ol></li><li> Pour générer NpuC-S-ACTU (C, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR NpuC, l&#39;ACTU et S fragmentationt [AG 3 (PEG)] 10 à partir du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, PET30-ACTU-Astuce1 10 et pQE9 AC 10 ATRP 12, respectivement, en utilisant les amorces appropriées. </li><li> Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine C-terminale de générer C (figure 2B). </li></ol></li><li> Pour générer NpuC-S-SH3 lig-ACTU (C-SH3 lig, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR utilisant des amorces contenant ACTU une lig SH3 (PPPALPPKRRR) et une liaison flexible (GGGGS) 2 pour générer fragment SH3 lig-ACTU. </li><li> Remplacer le gène de l&#39;ACTU de C avec un fragment de SH3 lig-ACTU. </li></ol></li><li> Pour générer SH3-GFP (tableau 1): <ol><li> Amplifier le gène SH3 de plasmide pJD757 13 en utilisant laamorces appropriées. </li><li> Fusionner ce fragment avec le gène de la GFP et l&#39;insérer dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 (figure 2C) et une 6xHistidine tag C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Expression de la protéine <ol><li> Transformer 50 ul d&#39;chimiquement compétente Escherichia coli BL21 (DE3) par le plasmide d&#39;expression approprié. </li><li> Après transformation, diluer en série de ces cellules, et de la plaque sur les Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose contenant 50 ug / ml de kanamycine. </li><li> Incuber les plaques contenant des cellules transformées à 37 ° C pendant environ 15 heures. </li><li> Après incubation, choisir une plaque qui contient 50-100 colonies et la suspension de toutes les colonies dans 5 ml de bouillon LB. </li><li> Transfert suspension à 1 L de bouillon LB contenant de la kanamycine (50 pg / ml) et la culture de cellules à 37 ° C avec agitation à 250 tours par minute. Surveillance de l&#39;absorbance à 600 nm (DO 600). Cultiver la culture jusqu&#39;à DO600 ~ 0,8. <ol><li> C et C-SH3 lig, induire l&#39;expression de protéine par addition d&#39;isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture (1 mM de concentration finale) et incuber la culture à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation à 250 tours par minute. </li><li> Pour les N-GFP et SH3, refroidir la culture à ~ 18 ° C en plongeant le flacon de culture dans un bain d&#39;eau glacée pendant ~ 5 min. Induire l&#39;expression de protéine par addition d&#39;IPTG à la culture (concentration finale 1 mM) et incuber la culture à 18 ° C pendant 14 à 18 heures avec une agitation à 250 tours par minute. </li></ol></li><li> Après expression de la protéine, centrifuger la culture à 6000 g pendant 20 min à 4 ° C pour recueillir le culot. culot cellulaire de magasin à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> La purification du N (conditions dénaturantes) <ol><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon A (tableau 2) à 10 ml / g de culot humide. </li><li> Immersenvoyer la suspension de granulés dans un bain d&#39;eau glacée et de rompre les cellules par traitement aux ultrasons (10 ampères, avec une impulsion de s et 6 s pause pendant 1 min). </li><li> Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans du tampon DA (contenant 8 M d&#39;urée) et centrifuger la suspension à 16 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Passez le surnageant à travers une colonne de 5 ml d&#39;acide Ni-nitrilotriacétique (NTA) préalablement équilibrée avec DA tampon. </li><li> Laver la colonne avec 30 ml de tampon DA supplémenté avec 45 mM d&#39;imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon DA supplémenté avec 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> Réduire la concentration d&#39;urée dans l&#39;échantillon de protéine à &lt;1 mM, soit par l&#39;une des méthodes suivantes données dans 3.1.7.1 3.1.7.2 ou: <ol><li> Dialyser la protéine dans du tampon DPBS (tableau 2) à 4 ° C pendant une nuit en utilisant des tubes avec &lt;20 kDa coupure. </li><li> Centrifugeuse purifié la protéine dans un 30 &amp; #160; kDa colonne de centrifugation ultra-filtration à 2800 x g, 4 ° C jusqu&#39;à ce que le volume est inférieur à 1 ml. Ajouter 14 ml de tampon DPBS à la colonne de diluer l&#39;échantillon de protéine. Répétez la centrifugation / dilution étapes trois fois. </li></ol></li><li> Après l&#39;échange de tampon, ajouter du dithiothréitol (DTT) à la protéine purifiée (finale 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml par centrifugation à travers une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa à 2800 x g, 4 ° C. </li><li> Aliquoter la protéine concentré et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Purification de C et C-SH3 lig (état natif) <ol><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon B (pH 6,0) (Tableau 2) complété avec un inhibiteur de protéase 1x cocktail à 10 ml / g de culot humide. Utilisation tampon acide pour réduire au minimum la dégradation protéolytique de la protéine cible. </li><li> Perturber suspension cellulaire par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. Centrifuger les lysmangé à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le surnageant. </li><li> Passer le lysat soluble à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avec du tampon B. </li><li> Laver la colonne avec du tampon B supplémenté avec 45 mM d&#39;imidazole, et éluer la protéine cible dans 20 ml de tampon B supplémenté avec 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> C, passez à l&#39;étape 3.2.6. C-SH3 lig, procéder à une étape de purification par échange d&#39;ions supplémentaires pour éliminer la protéine partiellement dégradée comme indiqué dans les étapes 3.2.5.1 à 3.2.5.3 <ol><li> Réduire la concentration de NaCl dans C-SH3 lig &lt;1 mM suivant la procédure décrite au point 3.1.7. </li><li> Charger la protéine cible sur un échangeur d&#39;anions ml perlé colonne de la matrice d&#39;agarose à 5 préalablement équilibrée avec du tampon phosphate de sodium (50 mM, pH 7,0). </li><li> Éluer la protéine cible à partir de la colonne par l&#39;exécution d&#39;un gradient à partir d&#39;une solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer à une solution contenant le même tampon additionné de NaCl 1 M. Prélever des échantillons au cours de l&#39;élution de la protéine et de mise en commun des échantillons avec la plus grande pureté sur la base de sodium dodécyl sulfate polyacrylamide L&#39;électrophorèse sur gel (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS, comme décrit dans 3.1.7. </li><li> Ajouter du DTT pour la protéine purifiée (concentration finale de 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. Aliquote et magasin concentrés de protéines à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> La purification de la GFP-SH3 <ol><li> culots cellulaires Remettre en suspension à l&#39;aide d&#39;un tampon A à 10 ml / g de culot humide. </li><li> Perturber culot suspension par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. </li><li> Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et collecter le surnageant. </li><li> Passer le surnageant (lysat soluble) à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avecTampon A. </li><li> Laver la colonne avec 30 ml de tampon A additionné de 45 mM d&#39;imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon A additionné de 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS utilisant une approche similaire à celle décrite dans 3.1.7 et concentrer la protéine de ~ 150 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. </li><li> Aliquote et magasin de protéines purifiées à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Analyse SDS-PAGE des échantillons purifiés contenant ACTU <ol><li> Diluer chaque protéine purifiée dans de l&#39;eau bidistillée pour réduire la concentration de NaCl à ~ 1 mM. A cette concentration de NaCl, la plupart des protéines ACTU trimères exploités en tant que monomères sur les gels SDS-PAGE. </li><li> Mélanger les échantillons avec un tampon échantillon SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% p / v de SDS, 0,1% p / v bromo-phénol bleu, 2% β-mercaptoéthanol), incubées à 95 ° C pendant 5 min. </li><li> Chargez le samples sur un gel SDS-PAGE à 12%. Effectuer l&#39;électrophorèse à une tension constante de 200 V pendant environ 50 min. </li><li> Observer les protéines dans les gels par coloration au bleu brillant de Coomassie R250 suivant les protocoles standards (Figure 1C). </li></ol></li></ol> 4. Hydrogel Formation REMARQUE: les hydrogels échantillons effectuées dans cette étude contiennent 1,6 mM de chaque bloc de construction d&#39;hydrogel, sauf indication contraire. Cette concentration de protéine donne un hydrogel souple et stable. ATTENTION: azide de sodium (NaN3) est ajouté à l&#39;hydrogel à une concentration finale de 0,5% p / v pour empêcher la contamination bactérienne. NaN3 est très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême, comme indiqué dans la fiche de données de sécurité. <ol><li> Calculer le volume de chacune des protéines concentrées nécessaires pour atteindre une concentration finale de 1,6 mM dans un échantillon de 100 ul hydrogel. Par exemple: Concentration de N:100 mg / ml Poids moléculaire de N: 26,3 kDa (voir le tableau 1) Concentration 100 pi désiré: Volume désiré 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Pour faire un pi hydrogel 100 (1,6 mM), mélange C (x pi, volume calculé d&#39;après 4,1) avec 5% de NaN 3 (10 ul), 100 mM de DTT (5 de pi) et N (y ul, volume calculé d&#39;après 4.1) à l&#39;intérieur d&#39;un flacon de 2 ml en verre. </li><li> Ajouter tampon DPBS ((85 - x - y) ul) dans le flacon pour obtenir un volume final de 100 ul, et mélanger tous les composants manuellement par l&#39;intermédiaire d&#39;un mouvement de tourbillonnement au moyen d&#39;un embout de pipette. Remarque: La solution devient très visqueuse lors du mélange. </li><li> Centrifuger le mélange pendant 2 min à 8000 xg pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Incuber le mélange à la chambretempérature pendant une nuit pour permettre à la réaction de trans-épissage d&#39;intéine pour atteindre l&#39;achèvement. Confirmez formation d&#39;hydrogel en tournant le tube à l&#39;envers. Les protéines ne seront pas versés si un hydrogel est formé. </li><li> Estimer le rendement de trans-épissage d&#39;intéine en vérifiant des échantillons (0,5 pi chacun) prélevés avant et après l&#39;étape 4.2 étape 4.5 sur un gel SDS-PAGE, tel que décrit au point 3.4 (figure 1C). </li></ol> 5. Immobilisation de la GFP via accueil Protein (DP) et station d&#39;accueil pour Peptide (DSP) Interaction <ol><li> Pour effectuer une 50 ul GFP-hydrogel fonctionnalisé (1,2 mM), combiner C-SH3 lig (x pi, calculé selon 4.1) et SH3-GFP (y ul, calculé selon 4.1) à 1:01 dans un rapport molaire de 1,7 ml microtube et incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter 5% de NaN3 (5 pi), 100 mM de DTT (2.5 pi), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) ul DPBS à la même tube. Ajouter N (y ul, calculé selon l&#39;4,1) pour atteindre un rapport molaire de 1:1 de N et C-SH3 lig. Mélanger l&#39;échantillon en utilisant une pointe de pipette par un mouvement tourbillonnant. </li><li> Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et laisser incuber le mélange à la température ambiante pendant une nuit dans l&#39;obscurité. Un hydrogel encapsulation formes SH3-GFP pendant l&#39;incubation. </li></ol> 6. L&#39;utilisation de mM hydrogel 1.6 comme un échafaudage d&#39;immobilisation pour la réaction enzymatique dans un solvant organique <ol><li> Utiliser la HRP comme enzyme de modèle. Préparer une solution stock de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) dans du DPBS. </li><li> Pour faire un hydrogel 30 ul (1,6 mM) piégeant HRP, combiner C (x pi, calculé selon 4.1) avec HRP (2 ul), 5% de NaN3 (3 pi) et du DTT (1,5 ul de 100 mM) dans un 1,7 ml tube de centrifugation. </li><li> Ajouter N (y &lt;/ Em&gt; pi, calculé conformément au point 4.1) et DPBS (23,5 - x - y) ul. Mélanger avec une pointe de pipette avec un mouvement tourbillonnant. </li><li> Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant une nuit. ATTENTION: les régents utilisés pour le dosage de l&#39;activité suivante sont hautement toxiques. Utilisez les recommandations de sécurité spécifiques par les fiches de données de sécurité correspondantes. </li><li> Par réaction enzymatique, immerger l&#39;hydrogel dans 1 ml de cocktail de réaction contenant du N, N-diméthyl-p-phénylène diamine (5,8 mM), du phénol (5,8 mM) et de l&#39;hydroperoxyde de tert-butyle (2,9 mM) dans du n-heptane 14. Perturber le gel manuellement en utilisant un embout de pipette pour augmenter la zone de surface de contact de l&#39;hydrogel et le solvant. </li><li> Détecter la HRP produit, un colorant du type indophénol, par mesure de l&#39;absorbance optique des échantillons prélevés à des moments différents à 546 nm dans un lecteur de plaque (Figure 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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Aucun intérêt financier concurrentes existent.

Dans ce travail, nous avons démontré la synthèse d&#39;un hydrogel de protéine induite par une intéine très stable. L&#39;utilisation d&#39;une fraction de l&#39;hydrogel permet intéine être conditionnellement formée en réponse au mélange de deux composants en phase liquide. Plus précisément, la scission de façon covalente relie intéine deux blocs de construction en phase liquide par une réaction de trans-épissage, ce qui donne une unité de polypeptide flanqué par des unités de réticulation...

Hydrogels entièrement en protéines transportent le potentiel de faire progresser considérablement domaines aussi divers que l&#39;ingénierie tissulaire, l&#39;administration de médicaments et biofabrication 1. Ils offrent des avantages plus hydrogels traditionnels de polymères synthétiques dont la biocompatibilité et la possibilité de soutenir de manière non invasive l&#39;incorporation de protéines globulaires bioactifs. Dans ce travail, nous décrivons le développement d&#39;un nouveau hydrogel protéique formé par l&#39;intermédiaire d&#39;une fraction de protéine induite par une intéine réaction de trans-épissage et de son application comme un échafaudage de protéines d&#39;immobilisation (figure 1). Les blocs de construction pour cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines, chacune comprenant le fragment N-ou C-terminale d&#39;une intéine dissociée (IN et IC) et une sous-unité d&#39;une protéine multimérique de réticulation. L&#39;intéine DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) a été utilisé comme le 2,3 intéine dissociée et une petite protéine trimérique (12 kDa) ACTU de Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; a été utilisé comme le 4,5 de protéine de réticulation. Différents agents de réticulation sont reliés par le biais réaction de trans-épissage d&#39;intéine catalysée, ce qui conduit à la formation d&#39;un réseau de protéines hautement réticulé (hydrogel). Npu intéine a été choisi en raison de sa cinétique de réaction rapide (t 1/2 = 63 sec) et le rendement de trans-épissage élevé (près de 80%) 2,3. La protéine de l&#39;ACTU a été choisi comme l&#39;agent de réticulation en raison de sa grande stabilité. ACTU trimères ont une température de dénaturation de près de 150 ° C et de conserver la structure quaternaire trimérique dans des solutions contenant pas moins de 5 M de chlorhydrate de guanidine 4,6. Depuis l&#39;échange d&#39;unité entre les différents agents de réticulation est un contributeur majeur de la surface hydrogel physique érosion 7, la très forte interaction entre la sous-unité dans l&#39;ACTU devrait décourager de tels échanges de sous-unités, conduisant à un hydrogel plus stable. L&#39;un de ces blocs de construction contient également un peptide S-fragment hautement hydrophile que le mi-bloc pour faciliter l&#39;eaurétention 8. Le mélange des deux éléments de base d&#39;hydrogel initie une réaction de trans-épissage entre l&#39;IN et IC fragments d&#39;intéine, la génération d&#39;une chaîne polypeptidique plus longtemps avec des agents de reticulation aux deux extrémités. Les agents de reticulation à partir de plusieurs de ces unités moléculaires interagissent les uns avec les autres, formant un réseau d&#39;hydrogel hautement réticulé (Figure 1A). Un «peptide station d&#39;accueil&quot; spécifique (DSP) est incorporé dans l&#39;un des blocs de construction d&#39;hydrogel pour faciliter l&#39;immobilisation stable d&#39;une &quot;protéine d&#39;amarrage» (DP) à marquage protéine cible dans l&#39;hydrogel. L&#39;utilisation d&#39;une intéine dissociée de servir de médiateur de l&#39;ensemble de l&#39;hydrogel non seulement fournit une flexibilité supplémentaire pour la synthèse de protéines de l&#39;hydrogel, mais permet également à haute densité, le chargement uniforme de la protéine cible dans l&#39;ensemble de l&#39;hydrogel, comme les protéines cibles sont chargées avant la formation de l&#39;hydrogel. La protéine hydrogel intéine médiation est très stable dans une solution aqueuse avec peu ou pas d&#39;érosion détectable après 3 mois à température ambiante. La stabilité est maintenue dans une large gamme de pH (6-10) et de températures (4-50 ° C), et l&#39;hydrogel est également compatible avec des solvants organiques. Cet hydrogel est utilisé pour l&#39;immobilisation de deux protéines globulaires: la protéine fluorescente verte (GFP) et de la peroxydase de raifort (HRP). Hydrogel emprisonner cette dernière protéine est utilisée pour réaliser la biocatalyse dans un solvant organique.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

Nous présentons la synthèse d&#39;un hydrogel de protéine hautement stable à médiation par une réaction de trans-épissage d&#39;intéine divisée catalysée par la protéine. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines contenant chacun une sous-unité d&#39;une protéine trimérique qui sert d&#39;agent de réticulation et une moitié d&#39;une intéine dissociée. Un enroulement aléatoire hautement hydrophile est insérée dans l&#39;un des copolymères séquences pour la rétention d&#39;eau. Le mélange des deux copolymères séquences de la protéine déclenche une réaction de trans-épissage d&#39;intéine, ce qui donne une unité de polypeptide avec des agents de réticulation à chaque extrémité qui rapidement s&#39;auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable dans les conditions acides et basiques, à des températures allant jusqu&#39;à 50 ° C, et dans des solvants organiques. L&#39;hydrogel rapidement des réformes après la rupture due au cisaillement. Constitution d&#39;une &quot;station d&#39;accueil peptide&quot; dans le bloc de construction d&#39;hydrogel permet l&#39;incorporation pratique de «protéine d&#39;accueil&quot; marqués protéines cibles.L&#39;hydrogel est compatible avec un milieu de croissance de culture de tissus, favorise la diffusion des molécules de 20 kDa, et permet l&#39;immobilisation de protéines globulaires bioactifs. L&#39;application de l&#39;hydrogel de protéine induite par une intéine en tant que biocatalyseur-solvant organique compatible avec l&#39;encapsulation a été démontrée par l&#39;enzyme de peroxydase de raifort et corroborer son activité.

Un schéma pour la formation induite par une intéine de protéines d&#39;hydrogel est présentée en figure 1A. Les blocs de construction de l&#39;hydrogel sont la protéine copolymères ACTU-NpuN (N) et NpuC-S-ACTU (C) (figure 1A, tableau 1). NpuN / C sont les N-/C-fragments du DnaE naturellement intéine dissociée de Nostoc punctiforme (Npu). L&#39;ACTU est une protéine trimérique stable de Pyrococcus horikoshii 4,5. Le mélange purifié de N et de C, en prése...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Nous présentons la synthèse d&#39;un hydrogel split-induite par une intéine de protéines. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères de protéines contenant chacun une sous-unité d&#39;une protéine trimérique qui sert d&#39;agent de réticulation et une moitié d&#39;une intéine dissociée. Le mélange des deux copolymères de protéine déclenche une réaction de trans-épissage d&#39;intéine, ce qui donne une unité de polypeptide qui s&#39;auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable au pH et à la température, compatible avec des solvants organiques, et incorpore facilement les protéines globulaires fonctionnels.

Synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K vues.  Texas A&M University, College Station.  Nous présentons la synthèse d'un hydrogel split-induite par une intéine de protéines. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères de protéines contenant chacun une sous-unité d'une protéine trimérique qui sert d'agent de réticulation et une moitié d'une intéine dissociée. Le mélange des deux copolymères de protéine déclenche une réaction de trans-épissage d'intéine, ce qui donne une unité de polypept...

Vidéo: Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Recherche

Bio-ingénierie

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Un supramoléculaire hydrogel injectable and Drug-chargé pour cathéter locale injection dans le Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Un additif de fabrication Technique pour la Fabrication rapide et Facile des Micromachines base d’Hydrogel avec composants magnétiquement sensibles

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D imprimés Cellulose poreuse Nanocomposite Hydrogel échafaudages

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Une plate-forme technologique open source pour fabriquer des modèles de culture 3D basés sur l’hydrogel de manière automatisée et standardisée

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.