Commencez par positionner la souris anesthésiée sur le porte-animaux et fixez-le à l’aide de deux bandes velcro. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel pour activer le laser. Ajustez le porte-animal pour centrer le laser dans l’œil de la souris.
Visualisez la partie postérieure à l’aide d’un aperçu sur le visage, du champ de vision du plexus vasculaire superficiel, d’un scan B et de la coupe transversale de la rétine dans le champ de vision. Acquérir une tomographie par cohérence optique en lumière visible, ou vis-volume OCT, après avoir effectué des ajustements mineurs de la mise au point optique. Alignez la tête du nerf optique dans chacun des quatre coins du champ de vision pour couvrir différentes zones rétiniennes.
Utilisez une méthode de seuil basée sur l’intensité pour détecter la surface de la rétine et générer des grammes de fibres vis-OCT à partir du volume. Recadrez la couche de fibres nerveuses rétiniennes, ou RNFL, en sélectionnant les 16 premiers micromètres de profondeur. Ensuite, calculez la projection de l’intensité moyenne le long de la direction axiale pour générer l’image de gramme de fibre composée de faisceaux d’axones de cellules ganglionnaires rétiniennes et de la vascularisation environnante.
Alignez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un éditeur graphique pour monter les quatre images en post-traitement. Le gramme de fibre vis-OCT composite est comparé à l’image confocale correspondante d’une rétine montée à plat immunocolorée avec TUJ1 pour les axones RGC. Les vaisseaux sanguins présentent des structures ramifiées distinctes qui peuvent être appariées aux vaisseaux sanguins marqués ICAM II sur l’image confocale.
La comparaison côte à côte entre la microscopie confocale ex vivo et la vis-OCT in vivo a révélé des réseaux de faisceaux d’exons RGC identiques et la vascularisation rétinienne environnante.
