Énucléer les yeux d’une souris euthanasiée, en marquant le côté temporal à des fins d’orientation. Retirez la chambre antérieure. Retirez ensuite le cristallin et le vitré et placez les œilletons dans le paraformaldéhyde pendant 30 minutes.
Lavez les œilletons avec du PBS pendant 30 minutes. Remplacement de la solution trois fois. Ensuite, lavez avec 0,5 % de Triton X-100 pendant 30 minutes.
Incuber les œilletons dans le tampon de blocage pendant deux heures à température ambiante. Après l’immunomarquage, isolez les rétines des œilletons à l’aide d’un microscope. Divisez les rétines en quatre feuilles et montez-les à plat avec la couche de cellules ganglionnaires rétiniennes vers le haut.
Assurez-vous que le repère du côté temporal reste attaché pour l’orientation. Couvrez les rétines avec du produit de montage. Placez les lamelles de recouvrement.
Et scellez les lames à l’aide de vernis à ongles. Allumez le microscope confocal et, sous le mode Localiser, recherchez la zone d’intérêt à l’aide de l’oculaire. Passez en mode Acquisition et configurez des tuiles pour couvrir l’ensemble de la rétine, ainsi que des tranches Z-Stack pour toutes les couches d’informations.
Imagez au moins 25 carreaux sur l’ensemble de la rétine pour obtenir un volume total. Projetez les tranches Z-Stack pour générer des images de microscopie confocale bidimensionnelles sur le visage. Le fibrogramme vis-OCT composite est comparé à l’image confocale correspondante d’une rétine montée à plat immunocolorée avec TuJ1 pour les axones RGC.
Les vaisseaux sanguins présentent des structures ramifiées distinctes qui peuvent être appariées aux vaisseaux sanguins marqués ICAM-2 sur l’image confocale. La comparaison côte à côte entre la microscopie confocale ex vivo et la vis-OCT in vivo a révélé des réseaux de faisceaux d’axones RGC identiques et une vascularisation rétinienne environnante.
