Cette étude est financée par la subvention Shaffer de la Fondation pour la recherche sur le glaucome, le prix de collaboration 4-CA Cavalier, R01EY029121, R01EY035088 et la Fondation Knights Templar Eye.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie et sont conformes aux directives sur l’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé (NIH). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Imagerie in vivo vis-OCT
<ol><li>Le système vis-OCT<ol><li>Imaginez les yeux des souris à l’aide d’un système vis-OCT pour petits animaux qui utilise une source de lumière supercontinuum, qui fournit un éclairage en lumière visible entre 480 nm et 650 nm. Assurez-vous que la puissance incidente sur la cornée est de 1 mW et utilisez un débit de ligne A de 25 kHz et un temps d’intégration de 39,3 μs par ligne A.</li>
		<li>Assurez-vous que la plage de détection spectrale du spectromètre est comprise entre 508 nm et 613 nm, ce qui donne une résolution axiale de 1,3 μm dans la rétine. Le volume total d’imagerie est d’environ 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1 500 μm (z). La résolution latérale est comprise entre 4,5 μm au centre du champ de vision et 8,7 μm à 350 μm du centre11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésie de la souris<ol><li>Anesthésier les souris de fond C57BL/6 et des deux sexes avec une injection intrapéritonéale de kétamine (114 mg/kg) et de xylazine (17 mg/kg) et dilater leurs pupilles à l’aide de gouttes de tropicamide à 1 %. Confirmer l’anesthésie adéquate par perte du réflexe de la pédale après un pincement ferme des orteils.</li>
		<li>Pendant l’imagerie, gardez la souris au chaud à l’aide d’une lampe chauffante infrarouge. Après chaque acquisition d’image, appliquez des larmes artificielles pour prévenir la déshydratation de la cornée.</li>
	</ol></li>
	<li>Positionnement de la souris pour l’imagerie<ol><li>Placez la souris anesthésiée sur le support animal et maintenez la souris en position à l’aide de deux bandes velcro. REMARQUE : Le support d’animal permet un mouvement en trois dimensions (réglage vertical, réglage horizontal fin, ainsi que des réglages de tangage et de lacet) pour placer le laser dans l’œil de la souris.</li>
	</ol></li>
	<li>Réglage des paramètres d’imagerie<ol><li>Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel référencé, qui allumera automatiquement le laser.</li>
		<li>Ajustez le support animal jusqu’à ce que le laser soit stable et centré dans l’œil de la souris. Visualisez la partie postérieure de l’œil à l’aide d’un aperçu En Face dans l’interface du logiciel, le champ de vision (FOV) du plexus vasculaire superficiel et un B-scan, la coupe transversale de la rétine dans le FOV.</li>
		<li>Acquérez un volume vis-OCT en cliquant sur le bouton Acquérir de l’interface logicielle après avoir effectué des réglages mineurs de la mise au point optique, qui se compose de 512 lignes A/B-scan et 512 B-scans/volume. REMARQUE : Ce processus prend ~10,5 s. L’acquisition d’images est guidée par un estimateur intégré de l’indice de qualité (QI) pour s’assurer que les images inférieures à un seuil prédéterminé (QI < 45) ne sont pas incluses.<ol><li>Pour chaque souris, acquérez quatre volumes vis-OCT du même œil. Alignez la tête du nerf optique (ONH) dans chacun des quatre coins du champ de vision pour couvrir différentes zones de la rétine. REMARQUE : Un tel placement minimise la courbure rétinienne, ce qui maximise la réflectance RNFL dans tout le champ de vision. Il faut ~1 min pour repositionner l’œil entre chaque acquisition (Figure 1A,B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Analyse vis-OCTF REMARQUE : MATLAB est utilisé pour effectuer l’analyse d’images.<ol><li>Pour générer des fibergrammes vis-OCT à partir du volume vis-OCT, utilisez une méthode de seuil basée sur l’intensité (ligne de code MATLAB 808) pour détecter la surface de la rétine. REMARQUE : Ces lignes utilisent la fonction d’imréglage pour ajuster les valeurs d’intensité du bscan. L’argument [0.0087 0.08] passé à imadjust spécifie la plage d’intensités à mapper sur la plage dynamique complète de l’image de sortie.</li>
		<li>Recadrez le RNFL en sélectionnant les premiers ~16 μm de profondeur. Voir la ligne de code Matlab 782. REMARQUE : L’épaisseur typique du RNFL in vivo chez une souris C57BL/6 adulte de type sauvage est de ~14 μm et peut varier selon les différentes méthodes de segmentation13.</li>
		<li>Modifiez les chemins d’accès du fichier RAW (ligne 9), des fichiers à reconstruire (ligne 11) et du nom du fichier (ligne 15), cliquez sur Exécuter et attendez que l’image OCT soit analysée par le code MATLAB. Calculez la projection de l’intensité moyenne le long de la direction axiale (z) (lignes de code MATLAB 905-908) pour générer l’image de fibrogramme composée de faisceaux d’axones RGC et de la vascularisation environnante. Montez les quatre images après le traitement du fibrogramme pour chaque champ de vision en alignant les vaisseaux sanguins avec un éditeur graphique de votre choix, couvrant ~1,2 x 1,2 mm au total. Les fichiers RAW sont généralement enregistrés dans le dossier : Halo Data, sous la date de l’imagerie OCT (par exemple, 0606 Opticent). REMARQUE : les codes MATLAB sont disponibles dans le fichier supplémentaire 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imagerie confocale ex vivo
<ol><li>Euthanasie de la souris<ol><li>Après avoir acquis les données vis-OCT, euthanasier les souris avec un mélange de pentobarbital sodique (390 mg/mL) et de phénytoïne sodique (50 mg/mL). La phénytoïne sodique agit en amplifiant les effets du pentobarbital sodique, qui a été largement utilisé dans l’euthanasie des rongeurs14,15. Pour chaque souris, utiliser 0,2 mL/20 g du mélange dilué (156 mg/mL) et perfuser avec 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis 20 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissection et orientation de l’œil<ol><li>Énucléez les yeux et faites une marque sur le côté temporal pour indiquer l’orientation.</li>
		<li>Après avoir retiré soigneusement la chambre antérieure, le cristallin oculaire, le vitré et fixer les œilletons en PFA pendant 30 min.</li>
		<li>Lavez les œilletons avec du PBS pendant 30 min et remplacez la solution PBS 3 fois pendant le lavage. Ensuite, laver avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS (pH 7,5) pendant 30 min.</li>
		<li>Incuber les œilletons dans un tampon bloquant (5 % de sérum d’âne avec 2,5 % d’albumine sérique bovine et 0,5 % de Triton X-100 dans une solution saline tamponnée Tris [pH 7,5]) pendant 2 h à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunomarquage REMARQUE : Les œilletons sont maintenant prêts à être colorés avec les anticorps primaires de souris anti-Tuj1 pour détecter les faisceaux d’axones RGC et anti-ICAM-2 de rat pour détecter les vaisseaux sanguins.<ol><li>Incuber les œilletons pendant la nuit avec les anticorps primaires, anti-Tuj1 de souris (1 :200 dans le tampon de blocage) et anti-ICAM-2 de rat (1 :500 dans le tampon de blocage), à 4 °C.</li>
		<li>Lavez les œilletons 3 à 5 fois pendant 1 h à chaque fois, avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,5 % de Triton X-100 (PBST) pour minimiser le bruit de fond et éliminer tout anticorps non lié.</li>
		<li>Après le lavage, incuber les œilletons pendant la nuit avec les anticorps secondaires, l’immunoglobuline G anti-souris conjuguée au colorant Alexa Fluor 488 (fluorescence verte) et les IgG anti-rat âne conjuguées au colorant Alexa Fluor 594 (fluorescence rouge), le tout dilué 1 :1000 dans un tampon bloquant, à 4 °C.</li>
		<li>Le lendemain, lavez les œilletons 3 à 5 fois pendant 1 h chacun avec du PBST pour minimiser le bruit de fond et éliminer les anticorps non liés.</li>
		<li>Transférez les œilletons dans une boîte de Pétri de PBS avant le support plat.</li>
	</ol></li>
	<li>Rétine montée à plat<ol><li>Après le processus d’immunomarquage, isolez les rétines des œilletons au microscope.</li>
		<li>Coupez les rétines en quatre feuilles et montez-les à plat avec la couche RGC vers le haut. Laissez la marque sur le côté temporal attaché à la rétine pour indiquer l’orientation.</li>
		<li>Glissez les rétines avec le support de montage13,18. Sceller les lames avec le vernis à ongles13,18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie confocale REMARQUE : Le traitement d’images confocales a été effectué à l’aide du logiciel de microscopie ZEN.<ol><li>Allumez le microscope confocal et, sous le mode Localiser, recherchez la zone d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope.</li>
		<li>En mode d’acquisition, configurez des vignettes pour couvrir l’ensemble de la rétine et des tranches z-stack pour couvrir toutes les couches d’informations. Imagez au moins 25 tuiles sur l’ensemble de la rétine pour couvrir le volume total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) à une taille de pixel de 1,24 μm/pixel.</li>
		<li>Projetez les tranches de la pile Z pour créer des images de microscopie confocale bidimensionnelle en face (Figure 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Alignement des images in vivo et ex vivo
<ol><li>Après avoir traité le fibrogramme, créez une image composite qui inclut les quatre images acquises à partir de chaque souris en alignant tous les vaisseaux sanguins avec l’éditeur graphique de votre choix. REMARQUE : En moyenne, l’image composite finale mesure environ 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), comme le montre la figure 1B.</li>
	<li>Utilisez la tête du nerf optique (ONH) et le motif des vaisseaux sanguins comme points de repère pour aligner le fibrogramme composite. Obtenir l’alignement in vivo et ex vivo en superposant le motif des vaisseaux sanguins des images OCT composites avec les images confococaux de la même rétine colorée avec ICAM-2.</li>
</ol>

Alignement du fibergramme OCT de la rétine de la souris avec des images confocales

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

Chang, S., Aucun ; Xu, W., Aucun ; Fan, W., Aucun ; McDaniel, J.A., Aucun ; D.A. Miller, Aucun; M. Grannonico, Aucun; M. Liu, Aucun; X. Liu, Aucun; H.F. Zhang a des intérêts financiers dans Opticent Health, qui n’a pas soutenu ce travail.

Il y a deux étapes dans ce protocole qui nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde et que ses yeux sont complètement dilatés avant l’imagerie vis-OCT. Si les souris ne sont pas correctement anesthésiées, leur respiration rapide peut entraîner des mouvements instables des images du visage , ce qui peut nuire à la qualité du fibrogramme. De plus, une dilatation insuffisante peut également avoir un impact néga...

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information visuelle, recevant des entrées synaptiques par l’intermédiaire de leurs arbres dendritiques dans la couche plexiforme interne (IPL) et transmettant l’information via leurs axones dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL) au cerveau 1,2,3,4. Dans les affections pathologiques telles que le glaucome, la dégénérescence précoce du CGR peut entraîner des changements subtils dans le RNFL, la couche de cellules ganglionnaires (GCL), l’IPL et le nerf optique chez les patients et les modèles de rongeurs 5,6,7,8,9. La détection précoce de ces changements morphologiques dans les CGR est donc essentielle pour une intervention rapide afin de prévenir les CGR et la perte de vision.
Nous avons récemment mis au point une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi, appelée tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCT), afin de répondre au besoin de surveillance in vivo des lésions du CGR. Vis-OCT a amélioré la résolution axiale, atteignant 1,3 μm dans la rétine10,11, ce qui a permis de visualiser les faisceaux axonales RGC individuels dans le RNFL. Par la suite, la fibre vis-OCT (vis-OCTF) a été établie pour suivre et quantifier les dommages au CGR au niveau du faisceau axonale unique chez les souris11,12,13. Cependant, l’imagerie confocale ex vivo de la même rétine que l’étalon-or est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo. Par conséquent, cette étude démontrera comment aligner les images in vivo acquises par vis-OCTF avec les images confococaux ex vivo de la même rétine de souris. Le protocole vise à valider les résultats in vivo par imagerie confocale ex vivo et à établir une base pour examiner les changements moléculaires et cellulaires sous-jacents aux dommages causés par le CGR dans des conditions pathologiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

Ces dernières années, l’imagerie rétinienne in vivo , qui fournit des informations non invasives, en temps réel et longitudinales sur les systèmes et les processus biologiques, a été de plus en plus utilisée pour obtenir une évaluation objective des lésions neuronales dans les maladies oculaires. L’imagerie confocale ex vivo de la même rétine est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo , en particulier dans la recherche animale. Dans cette étude, nous avons démontré une méthode d’alignement d’une image confocale ex vivo de la rétine de souris avec ses images in vivo . Une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi appelée fibre de tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) a été appliquée pour acquérir des images in vivo de la rétine de souris. Nous avons ensuite réalisé l’imagerie confocale de la même rétine que le « gold standard » pour valider les images in vivo vis-OCTF. Cette étude permet non seulement d’approfondir l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires, mais aussi d’établir les bases d’une évaluation sensible et objective des lésions neuronales in vivo.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de l’imagerie rétinienne in vivo et ex vivo pour améliorer le diagnostic et le traitement du glaucome 

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

Le fibrogramme vis-OCT composite est comparé à l’image confocale correspondante d’une rétine montée à plat immunocolorée avec Tuj-1 pour les axones RGC (Figure 1D, panneau supérieur). Les faisceaux d’axones imagés par vis-OCTF peuvent être appariés avec les faisceaux d’axones marqués Tu-j1 sur l’image confocale. Les vaisseaux sanguins présentent généralement des structures ramifiées distinctes par rapport aux faisceaux axonaux environnants dans les images de fibrogra...

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Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Nous présentons un protocole d’alignement d’images VIS-OCT in vivo avec des fibres nerveuses rétiniennes immunocolorées ex vivo afin de valider notre nouvelle technologie d’imagerie. VIS-OCT permet de visualiser les fibres nerveuses rétiniennes in vivo, et ce processus confirme l’exactitude de nos résultats. Notre protocole combine l’imagerie in vivo et ex vivo pour fournir une visualisation en temps réel de la structure de la rétine et confirmer les résultats.Le procédé est applicable à des modèles murins de maladies oculaires, à condition que la partie antérieure de l’œil permette l’imagerie optique. Cela inclut les modèles de rétinopathie diabétique et d’ischémie rétinienne. Ces études jettent les bases de l’établissement d’une évaluation objective des dommages neurologiques chez l’homme, ce qui peut améliorer considérablement le diagnostic et le traitement du glaucome à l’avenir.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

883 vues.  University of Virginia. Nous présentons un protocole d’alignement d’images VIS-OCT in vivo avec des fibres nerveuses rétiniennes immunocolorées ex vivo afin de valider notre nouvelle technologie d’imagerie. VIS-OCT permet de visualiser les fibres nerveuses rétiniennes in vivo, et ce processus confirme l’exactitude de nos résultats. Notre protocole combine l’imagerie in vivo et ex vivo pour fournir une visualisation en temps réel de la structure de la rétine et confirmer les résultats.Le proc...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Progrès de l’imagerie rétinienne in vivo et ex vivo pour améliorer le diagnostic et le traitement du glaucome 

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Recherche

Neurosciences

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Tomographie par cohérence optique (OCT) en lumière visible in vivo Imagerie rétinienne de souris

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Imagerie confocale ex vivo de la rétine de souris

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.