Nous remercions le Dr Evan Jellison et Mme Li Zhu du centre de cytométrie en flux de UConn Health pour leur aide en matière de cytométrie en flux, le Dr Lynn Puddington du département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments, Mme Slawa Gajewska et le Dr Paul Appleton du noyau de recherche clinique de UConn Health pour leur aide dans l’obtention d’échantillons de sang. Nous remercions le Dr Christopher « Kit » Bonin et la Dre Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour leur aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (P20GM121176), aux États-Unis, d’un prix de développement de carrière de l’American Heart Association (18CDA34110426) et d’un fonds de démarrage de UConn Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Des échantillons de sang total hépariné ont été obtenus auprès de donneurs humains sains anonymisés après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par l’Institutional Review Board de UConn Health, conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé de tous les donneurs a été obtenu. Les critères d’inclusion et d’exclusion de cette étude ont été soigneusement élaborés afin de s’assurer de la pertinence des participants et de minimiser les risques potentiels. Les participants admissibles étaient âgés de 18 à 65 ans, de toute origine ethnique, parlant couramment l’anglais et capables de donner un consentement éclairé. Les participants exclus comprenaient ceux qui n’étaient pas en mesure de donner un consentement éclairé pour eux-mêmes, comme ceux qui avaient besoin d’un représentant légalement autorisé, les personnes de moins de 18 ans ou de plus de 65 ans, les personnes incarcérées et les femmes enceintes. De plus, les participants devaient être exempts d’utilisation de médicaments anti-inflammatoires et de conditions inflammatoires. Les infections actuelles ou les affections inflammatoires chroniques ou aiguës persistantes étaient également des critères d’exclusion. Enfin, les personnes ayant des antécédents actuels ou récents d’infection à la COVID-19 n’étaient pas admissibles à l’étude. Ces critères ont été conçus pour assurer la sécurité et l’adéquation des participants tout en minimisant les facteurs de confusion potentiels qui pourraient avoir une incidence sur les résultats de l’étude.
1. Préparation des réactifs
<ol><li>Milieu neutrophile : Préparer le milieu neutrophile en ajoutant 2 % d’albumine sérique humaine au RPMI-1640 sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Solution de fMLP : Préparer la solution de fMLP en la diluant 100 fois à partir de la solution de stockage de 10 mM de diméthylsulfoxyde de diméthyle (DMSO) de fMLP (voir le tableau des matériaux) avec RPMI 1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une solution de 100 μM de fMLP.</li>
	<li>Solution d’anticorps : Diluer 120 μL d’anticorps monoclonal conjugué à l’allophycocyanine (APC) mAb24 (mAb24-APC) (voir le tableau des matériaux), qui fait état de la conformation de haute affinité de l’intégrine β2, dans 10 mL de milieu neutrophile, créant ainsi une solution de mAb24-APC à 1,2 μg/mL.</li>
	<li>Bibliothèque de composés : Diluer la bibliothèque initiale de composés avec une concentration de 10 mM à 1 mM en ajoutant 5 μL de la bibliothèque de 10 mM (voir le tableau des matériaux) à 45 μL de DMSO dans des plaques de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides. Par la suite, transférez 5 μL par puits de la bibliothèque de composés de 1 mM sur une plaque vide de 384 puits à l’aide du manipulateur de liquides.</li>
	<li>Comme l’illustre la figure 1, quatre colonnes (1, 2, 23, 24) ne contenaient que du DMSO, mais aucun composé, servant de témoins positifs et négatifs dans le criblage. Diluer davantage chaque puits en ajoutant 45 μL de RPMI-1640 sans rouge de phénol, ce qui donne une concentration finale de 100 μM pour tous les composés.</li>
</ol>2. Isolement des neutrophiles du sang humain
<ol><li>À l’aide d’une pipette sérologique, superposer soigneusement 4 mL de sang sur 8 mL d’un milieu à gradient de densité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 15 mL (figure 2A).</li>
	<li>Centrifuger le sang à 550 × g pendant 30-50 min à 20 °C. Décélérez progressivement le rotor (facteur de décélération de 1). REMARQUE : La séparation réussie des neutrophiles (bande 2 de la figure 2B) des globules rouges peut varier d’un donneur à l’autre. Pour la plupart des donneurs, une centrifugation de 30 minutes suffit. Cependant, pour certains donneurs, une centrifugation supplémentaire de 10 à 30 minutes peut être nécessaire si la séparation n’est pas réussie (Figure 2C).</li>
	<li>Retirez délicatement le plasma (le liquide jaune sur le dessus) et les cellules mononucléées (la bande trouble supérieure ; PBMC de la figure 2B) à l’aide d’une pipette de 1 mL.</li>
	<li>Recueillir les neutrophiles de la bande trouble inférieure (bande des neutrophiles sur la figure 2B) et à environ 3 à 4 mL sous le liquide clair dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez délicatement la suspension de neutrophiles en l’inversant 2 à 3 fois.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 400 × g pendant 10 min à 20 °C, puis retirer délicatement le surnageant par décantation.</li>
	<li>Remettre délicatement la pastille en suspension avec 5 mL de PBS et la centrifuger à 300 × g pendant 5 min à 20 °C.</li>
	<li>Retirez le surnageant en le décantant et éliminez soigneusement tout surnageant résiduel autour de l’embouchure du tube et sur la paroi du tube à l’aide d’une aspiration sous vide. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu neutrophile.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. En règle générale, 1 à 4 × 107 neutrophiles ont été obtenus à partir de 8 mL de sang humain. REMARQUE : Il peut y avoir une contamination par les globules rouges dans la suspension de neutrophiles. Les globules rouges n’affectent pas de manière significative la plupart des tests et peuvent empêcher l’activation/l’amorçage des neutrophiles27. Les globules rouges doivent être lysés avant d’être comptés pour obtenir une concentration précise de neutrophiles. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire à 891 μL d’eau déminéralisée pendant 10 à 30 s pour lyser les globules rouges, puis ajouter 99 μL de PBS 10× pour équilibrer la pression osmotique, empêchant ainsi la lyse des neutrophiles.</li>
	<li>Ajustez la densité cellulaire à 6,25 × 105 cellules/mL en ajoutant du milieu neutrophile.</li>
</ol>3. Préparation de la plaque à 384 puits
<ol><li>Dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, mélanger 1 mL de solution d’anticorps (1,2 μg/mL de mAb24-APC) avec 0,2 mL de milieu neutrophile pour créer une solution de mAb24-APC de 1 μg/mL. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins négatifs d’une plaque à 384 puits (les puits bleus de la figure 1).</li>
	<li>Dans un tube à centrifuger de 15 mL, mélanger 9 mL de la solution d’anticorps avec 21,6 μL de solution fMLP (100 μM) et 1,7784 mL de milieu neutrophile pour créer une solution contenant 1 μg/mL de mAb24-APC et 200 nM de fMLP. Ensuite, ajoutez 25 μL de ce mélange dans les puits témoins positifs et d’essai dans une plaque de 384 puits (les puits rouge et bleu de la figure 1).</li>
	<li>Transférez 5 μL des solutions composées de 100 μM de la plaque de la bibliothèque de composés à la plaque de 384 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Centrifuger le liquide pendant 1 min à 500 × g, à température ambiante. REMARQUE : Pour centrifuger les plaques, un rotor à godets oscillants et des godets à plaques sont nécessaires.</li>
</ol>4. Traitement des cellules
<ol><li>Ajouter 20 μL de suspension de neutrophiles dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (plage de 5 à 50 μL, pour chaque colonne de la plaque à 384 puits). Mélangez délicatement 5 à 10 fois à l’aide de la pipette, en maintenant un intervalle de temps constant entre chaque pipetage. NOTA : Les concentrations finales dans les puits sont les suivantes : neutrophiles 2,5 × 105 cellules/mL (tous les puits) ; mAb24-APC 0,5 μg/mL (tous les puits) ; fMLP 100 nM (puits de contrôle positif et d’essai) ; composés 10 μM (puits d’essai).</li>
	<li>Incuber la plaque sur un shaker à 300 tr/min, à température ambiante (RT), pendant 10 min.</li>
	<li>Fixez les cellules en ajoutant 3 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 16 % dans chaque puits à l’aide d’une pipette à 16 canaux (concentration finale de PFA ~0,91 %). Ensuite, incuber sur glace pendant 10 min. REMARQUE : Il est recommandé de maintenir un intervalle de temps constant entre les différentes colonnes lors de l’ajout de neutrophiles et de PFA. Cela garantit que les neutrophiles de chaque puits ont le même temps d’incubation avec fMLP et mAb24-APC.</li>
</ol>5. Cytométrie en flux
<ol><li>Mettez le cytomètre en flux sous tension (voir Tableau des matériaux) et assurez-vous que l’ordinateur connecté à l’instrument est également allumé.</li>
	<li>Assurez-vous que le réservoir de liquide de la gaine est rempli et que le conteneur à déchets est vide et correctement connecté à l’instrument.</li>
	<li>Chargez la plaque à 384 puits sur le chargeur d’échantillons du cytomètre en flux. Assurez-vous que le puits A1 de la plaque est aligné avec le repère A1 sur le chargeur.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel et créez une nouvelle expérience. Sélectionnez le puits 384 et choisissez les fluorophores souhaités. Ensuite, cliquez sur Configuration de la plaque, faites glisser pour sélectionner tous les puits, puis cliquez sur Échantillon. Activez le commutateur « Débit élevé » et sélectionnez Haut sous le panneau de débit.<ol><li>Dans la zone de volume, entrez 50. Sélectionnez les échantillons dans des colonnes impaires, puis activez le commutateur « Agitation ». Enfin, nommez les échantillons dans le panneau de droite.</li>
	</ol></li>
	<li>Cliquez sur Tracer et porte. Ensuite, cliquez sur le bouton Appliquer (deux flèches sur un cercle rempli de vert), puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire). Attendez quelques secondes pour observer quelques cellules du premier puits, puis cliquez sur le bouton pause .<ol><li>Ajustez les tensions FSC et SSC pour assurer une bonne visualisation des cellules sur le tracé. Cliquez sur Acquisition, puis cliquez sur le bouton de lecture (forme triangulaire) pour lancer le test.</li>
	</ol></li>
	<li>Le cytomètre en flux échantillonnera séquentiellement ~50 μL de 1000 à 3000 neutrophiles de chaque puits. Il faudra environ 3 h pour compléter l’ensemble de la plaque de 384 puits.</li>
	<li>Une fois tous les exemples terminés, exportez les fichiers .fcs pour passer à l’étape suivante.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’analyse des données de cytométrie en flux (voir Table des matériaux). Sélectionnez et faites glisser le dossier contenant tous les fichiers .fcs dans la fenêtre du logiciel, puis relâchez-le pour importer les données dans le logiciel.</li>
	<li>Double-cliquez sur un échantillon, mettez en grille les neutrophiles simples basés sur FSC et SSC28,29,30 dans la fenêtre contextuelle, comme illustré à la figure 3. Sélectionnez les lignes fermées et faites-les glisser vers le dossier, puis relâchez-les pour appliquer la barrière à tous les échantillons de ce dossier.</li>
	<li>Calculez et exportez l’intensité de fluorescence médiane (MFI) APC des neutrophiles de chaque puits à l’aide de la fonction d’édition de table du logiciel. Cliquez sur Ajouter une colonne sous l’onglet Modifier . Sélectionnez Médiane dans l’onglet Statistique , choisissez les neutrophiles de population contrôlés, puis sélectionnez APC comme paramètre. Cliquez sur le bouton OK .</li>
	<li>Retournez à l’onglet « Editeur de table », sélectionnez Tous les échantillons dans l’onglet « Groupe » et appuyez sur le bouton Créer une table . Une nouvelle fenêtre apparaîtra affichant le tableau créé. Enregistrez-le sous forme de fichier texte, CSV ou Excel.</li>
	<li>Ouvrez le tableau exporté, calculez la valeur moyenne et l’écart-type de l’IMF APC pour les échantillons témoins positifs et négatifs (Figure 4).</li>
	<li>Calculer le facteur Z' (Z') de la plaque à l’aide de l’équation : Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), où σ p et σ n sont les écarts-types des témoins positifs et négatifs, respectivement, et μp et μn sont les moyennes des témoins positifs et négatifs, respectivement31. NOTE : Le facteur Z' indique la séparation des distributions de contrôle positives et négatives. Un Z' de 0 signifie qu’il n’y a pas de séparation, tandis qu’un Z' de 0,5 indique une séparation égale. Comme mentionné dans une étude précédente31, le > de Z de 0,5 indique un excellent test pour le criblage des composés. Un Z' compris entre 0,5 et 0 est acceptable, mais il se peut qu’il n’identifie que des résultats forts dans le test, ce qui nécessitera une validation supplémentaire dans les tests secondaires.</li>
	<li>Considérer les composés comme des « résultats » pour le criblage lorsque l’IMF APC des neutrophiles traités par composé est inférieur à trois fois l’écart-type de l’IMF témoin positif soustrait de l’IMF témoin positif (P = 0,0013, représenté par la ligne pointillée de la figure 4).</li>
</ol>

Criblage d’inhibiteurs de l’activation de l’intégrine β2 dans les neutrophiles humains

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

L’initiation et l’arrêt de la stimulation et de la coloration des neutrophiles sont déterminés par l’ajout de neutrophiles et du PFA fixateur. Par conséquent, il est essentiel d’assurer le même intervalle de temps entre le pipetage des neutrophiles ou de l’APF dans chaque colonne. Cela garantit que le temps de stimulation et de coloration des neutrophiles de chaque puits reste constant. En raison de la courte durée de vie des neutrophiles, l’ensemble de l’expérience, de la collecte de sang des donneu...

De nombreuses maladies inflammatoires sont caractérisées par l’infiltration de neutrophiles sur le site d’un gonflement ou d’une blessure1. Pour infiltrer ces tissus, les neutrophiles doivent compléter la cascade de recrutement des neutrophiles, qui implique l’arrêt de l’endothélium, l’extravasation à travers la paroi du vaisseau et le recrutement dans le tissu2. Les neutrophiles circulants ont besoin de l’activation de l’intégrine β2 pour compléter cette cascade, en particulier pour la phase d’arrêt. Ainsi, les médicaments inhibiteurs de l’intégrine qui réduisent l’adhésion, l’extravasation et le recrutement des neutrophiles peuvent traiter efficacement les maladies inflammatoires 3,4.
Les intégrines β2 ont déjà été ciblées pour des maladies inflammatoires. L’efalizumab, un anticorps monoclonal ciblant directement l’intégrine αLβ2, a été développé pour traiter le psoriasis5. Cependant, l’efalizumab a été retiré en raison de son effet secondaire mortel - une leucoencéphalopathie multifocale progressive résultant de la réactivation du virus JC 6,7. Les nouveaux traitements anti-inflammatoires à base d’intégrine devraient envisager de maintenir les fonctions anti-infectieuses des leucocytes afin de minimiser les effets secondaires. Les effets secondaires de l’efalizumab pourraient être dus à la circulation prolongée d’anticorps monoclonaux dans le sang, ce qui pourrait inhiber les fonctions immunitaires à long terme8. Une étude récente montre que l’efalizumab intervient dans la réticulation de l’αLβ2 et l’internalisation indésirable des intégrines α4, fournissant une explication alternative des effets secondaires9. Ainsi, les antagonistes à petites molécules à courte durée de vie pourraient éviter ce problème.
Une méthode à haut débit pour cribler les antagonistes de l’intégrine β2 de petites molécules à l’aide de neutrophiles humains est présentée ici. L’activation de l’intégrine β2 nécessite des changements conformationnels de l’ectodomaine de l’intégrine pour accéder à son ligand et augmenter son affinité de liaison avec celui-ci. Dans le modèle canonique à cran d’arrêt, l’ectodomaine de l’intégrine courbée-fermée s’étend d’abord jusqu’à une conformation étendue-fermée, puis ouvre sa coiffe à une conformation ouverte-étendue entièrement activée10,11,12,13. Il existe également une voie alternative qui part de la fermeture courbée à l’ouverture courbée et à l’ouverture étendue, éventuellement 14,15,16,17,18,19. L’anticorps spécifique de la conformation mAb24 se lie à un épitope dans le domaine humain de type β2-I lorsque la coiffe de l’ectodomaine est ouverte20,21,22,23.
Ici, mAb24-APC est utilisé pour déterminer si les intégrines β2 sont activées. Pour activer les neutrophiles et l’intégrine, la N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP), un peptide chimiotactique court d’origine bactérienne capable d’activer les intégrines β2 des neutrophiles24, est utilisée comme stimulus dans ce protocole. Lorsque fMLP se lie à Fpr1 sur les neutrophiles, des cascades de signalisation en aval impliquant des protéines G, la phospholipase Cβ et la phosphoinositide 3-kinase γ sont activées. Ces événements de signalisation aboutissent finalement à l’activation de l’intégrine via la voie de signalisation de l’intérieur vers l’extérieur18,25. Outre les antagonistes de petites molécules qui se lient directement aux intégrines β2 et empêchent les changements conformationnels de l’activation de l’intégrine26, des composés capables d’inhiber les composants de la voie de signalisation d’activation de l’intégrine β2 de l’intérieur vers l’extérieur seraient également détectés avec cette méthode. Les cytomètres en flux automatisés permettent un criblage à haut débit. L’identification de nouveaux antagonistes peut non seulement approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, mais aussi fournir des informations translationnelles sur le traitement anti-inflammatoire à base d’intégrine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Ce protocole vise à établir une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2, en utilisant des anticorps rapporteurs de changement conformationnel et une cytométrie en flux à haut débit. La méthode peut également servir de guide pour d’autres méthodes de criblage à haut débit à base d’anticorps. Les intégrines β2 sont des molécules d’adhésion spécifiques aux leucocytes qui sont cruciales dans les réponses immunitaires. Les neutrophiles dépendent de l’activation de l’intégrine pour sortir de la circulation sanguine, non seulement pour combattre les infections, mais aussi pour être impliqués dans de multiples maladies inflammatoires. Le contrôle de l’activation de l’intégrine β2 présente une approche viable pour le traitement des maladies inflammatoires associées aux neutrophiles. Dans ce protocole, un anticorps monoclonal, mAb24, qui se lie spécifiquement à la coiffe de haute affinité des intégrines β2, est utilisé pour quantifier l’activation de l’intégrine β2 sur des neutrophiles humains primaires isolés. La N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP) est utilisée comme stimulus pour activer les intégrines β2 des neutrophiles. Un cytomètre en flux à haut débit capable d’analyser automatiquement des échantillons de plaques à 384 puits a été utilisé dans cette étude. Les effets de 320 produits chimiques sur l’inhibition de l’intégrine β2 sont évalués dans les 3 heures. Les molécules qui ciblent directement les intégrines β2 ou les molécules cibles dans la voie de signalisation d’activation de l’intégrine initiée par le récepteur couplé aux protéines G peuvent être identifiées grâce à cette approche.

Les données d’un criblage représentatif de plaques à 384 puits (Figure 4) ont révélé que les témoins négatifs avaient une MFI de mAb24-APC de 3236 ± 110, tandis que les témoins positifs avaient une MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. Le facteur Z' de cette plaque est d’environ 0,33, ce qui se situe dans une plage acceptablede 31. Cependant, Z' nécessite une validation supplémentaire dans les tests secondaires.
Pour normaliser l...

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Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2 

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Notre recherche est axée sur l’intégrine neutrophile, et dans cette étude, nous visons à établir une méthode pour trouver de petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine bêta-2. Nous pensons qu’avec cette méthode, nous pouvons trouver de nouveaux antagonistes qui pourraient approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, et également fournir un aperçu translationnel de la thérapie anti-inflammatoire à base d’intégrine. À l’avenir, nous nous concentrerons sur la découverte de nouveaux anti-inflammatoires et la dissection de leurs mécanismes d’action.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.5K vues.  UConn Health. Notre recherche est axée sur l’intégrine neutrophile, et dans cette étude, nous visons à établir une méthode pour trouver de petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine bêta-2. Nous pensons qu’avec cette méthode, nous pouvons trouver de nouveaux antagonistes qui pourraient approfondir notre compréhension de la physiologie de l’intégrine, et également fournir un aperçu translationnel de la thérapie anti-inflammatoire à base d’intégrine. À l’a...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développement d’une méthode d’identification des petits antagonistes moléculaires de l’activation de l’intégrine β2 

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Recherche

Immunologie et infection

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Mesure des anticorps naturels acquis de phagocytose induisant des parasites de plasmodium falciparum par un essai basé sur la cytométrie de flux

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Methods Article

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine