Nous remercions le Dr Yves L. Janin pour ses commentaires et suggestions fructueuses. Nous tenons à remercier HH Gad pour CHIK / Ren et C. Combredet pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut Pasteur, le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), l&#39;Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Programme STING à POV et HM- L), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR-DGITRN, Programme STING 2.0 pour POV), et le &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (projet de bibliothèque chimique, les subventions n ° 06-222 je / R et I 09-1739 / R pour HM-L.). Le travail sur CHIKV / Ren a été soutenue par les ArbOAS de projets (ANR subvention 2010-INTB-1601-02).

1. Préparation de 96 puits fille plaques avec les composés <ol><li> Déplacer plaques mères à 96 puits contenant 10 mM de solutions de composés chimiques dans le DMSO à partir de -20 ° C à la température ambiante. Diluer composés 5x dans le DMSO pour obtenir des plaques de dilution 96 puits intermédiaires à 2 mM. La dilution est réalisée par pipetage de 5 ul dans 20 ul de DMSO et de mélange. </li><li> 1 ul de plaques de dilution dans les puits sec de blanc, de culture de tissu à code à barres des plaques 96 puits. Ce premier ensemble de plaques-filles (D1) seront utilisées pour évaluer la toxicité des composés à une concentration finale de 20 uM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Diluer composés encore 1h10 par pipetage 4 pi à partir de plaques de dilution dans 36 ul de DMSO et le mixage. 1 ul dans les puits à sec de blanc, à fond plat, la culture de tissus code à barres 96 puits plaques. Ce second ensemble de plaques-filles (D2) sera utilisé pour évaluer l&#39;inhibition de la MV replication par les composés à une concentration finale de 2 pM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Préparation de cultures cellulaires pour déterminer la toxicité de composés <ol><li> Cultiver des cellules HEK-293T à 37 ° C et 5% de CO2 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec stabilisation de L-glutamine et supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS), de la streptomycine (100 ug / ml) et de la pénicilline (100 UI / ml). Les cellules sont repiquées par traitement à la trypsine tous les 4-5 jours, et dilués 01h10 dans un nouveau flacon. Les cellules doivent être en phase de journal pour des expériences. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, de récupérer les cellules par traitement à la trypsine et d&#39;effectuer le comptage des cellules. Pellet cellules par centrifugation et les remettre en suspension à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage. </li><li> cellules de transfert à un creux, et distribuer 100 pi de suspension cellulaire dans des plaques contenant D1 pointes compo chimiqueonds. Suspension cellulaire à l&#39;intérieur de l&#39;auge est régulièrement agité pour éviter la sédimentation. </li><li> De Spike contrôle puits A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 et G12 avec 1 ul de DMSO. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules vivantes (pas de toxicité). Spike contrôle puits B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 et H12 avec 1 ul de DMSO et 2,5 ul d&#39;une solution d&#39;IGEPAL à 0,5% pour tuer les cellules. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules mortes (forte toxicité). </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Préparation de cultures de cellules infectées par rMV2/Luc <ol><li> Développer et récupérer les cellules comme décrit dans 2.1 et 2.2. Encore une fois, remettre les cellules à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage. </li><li> En option: supplément de milieu de culture avec l&#39;uridine à 20 pg / ml. Remarque: Lors de criblage de banques chimiques pour replicatio viralen inhibiteurs, il semble que les composés ciblant les étapes précoces de la voie de biosynthèse de la pyrimidine sont fréquemment isolés 13,16,27,28. L&#39;ajout d&#39;uridine au milieu de culture est utilisé pour filtrer de telles molécules antivirales. En effet, cette restaure efficacement la réplication virale lors enzymes amont de voie de biosynthèse de la pyrimidine sont bloqués. </li><li> Enregistrer 1:10 de suspension de cellules dans les puits de contrôle avec des cellules non infectées, et procéder à l&#39;infection par le volume restant. </li><li> Décongeler le volume approprié de rMV2/Luc solution stock. Solutions mères MT sont généralement à 10 6 -10 8 particules infectieuses par ml. La culture doit être infectée par des particules infectieuses de 0,1 rMV2/Luc par des cellules cibles, ce qui correspond à 0,1 multiplicité d&#39;infection (MOI). Remarque: rMV2/Luc est dérivé du vaccin MV (souche Schwarz) et est manipulé dans un environnement de BSL2. </li><li> Ajouter le virus de la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer les cellules infectées à un creux, et verser 100pl de suspension cellulaire infectée dans les colonnes 2 à 11 de D2 plaques contenant des composés chimiques dopés. La suspension cellulaire dans l&#39;auge est régulièrement mélangé doucement. </li><li> Dans les colonnes 1 et 12, passer de 100 pi de cellules non infectées et un sur deux. Les cellules infectées sont distribués dans les autres puits. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 4. Mesures d&#39;activité de la luciférase et l&#39;analyse des données <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur D1, et déterminer la viabilité cellulaire en ajoutant 50 ul de réactif à base de luciférase-viabilité directement à des puits de culture. Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lire les plaques d&#39;un luminomètre. Le temps d&#39;intégration est fixé à 100 ms par puits. </li><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur D2, et déterminer l&#39;activité de la luciférase en ajoutant 50 pl de substrat de la luciférase directement aux puits de culture. Incuber pendant 6 min à température ambiante, et lire les plaques avec un luminomètre que descriLit ci-dessus. </li><li> Calculer un facteur Z&#39;-D1 pour chaque plaque de l&#39;essai de toxicité pour justifier la qualité de l&#39;écran 29. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), où μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules HEK-293T avec DMSO seul (pas de toxicité), et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les puits de culture traités avec IGEPAL pour tuer les cellules. Z &#39;est prévu au-dessus de 0,5, ou la plaque correspondante est éliminée. </li><li> Régler le seuil de toxicité à μ + / 2. Jeter composés avec des valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3A). </li><li> Calculer un facteur Z &#39;pour chaque plaque D2 de l&#39;analyse antivirale. Ici, μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules infectées en culture avec du DMSO seul, et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules non infectées. Encore une fois, avec plaques Z &amp; #39; des valeurs inférieures à 0,5 sont éliminés. </li><li> Calcul de l&#39;inhibition de la réplication virale de la manière suivante: pourcentage d&#39;inhibition = (μ + - activité de la luciférase pour le composé X) / (μ + - μ-) * 100. Régler le seuil d&#39;inhibition à 75%, et sélectionner des composés qui à la fois réduisent les valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3B) et ne sont pas toxiques, selon les critères décrits dans la section 4.4. </li></ol> 5. L&#39;écran secondaire de la toxicité et à large spectre d&#39;activité antivirale <ol><li> Assurez-01h02 dilutions en série pour chaque frappé composé dans le DMSO, à partir de 500 um à 4 um (8 dilutions). Remplir blancs, des plaques de culture tissulaire à code à barres avec 50 ul de milieu de culture. Ajouter 1 pi de chaque dilution de composé dans des puits de culture. Répéter deux fois pour avoir 3 plaques de culture avec des dilutions en série en double pour chaque composé de succès. </li><li> Préparer 37,5 ml d&#39;une suspension de cellules HEK-293T à 6 x 10 5 cellules / ml dans un milieu de culture tel que décrit ci-dessus (en 2.1 et 20,2). Distribuer 2x 12,5 ml dans des tubes Falcon et infecter les cellules avec soit rMV2/Luc à MOI = 0,1 ou CHIKV recombinant exprimant la luciférase de Renilla (CHIKV / s) à une MOI = 0,2. Mélanger par inversion. Remarque: CHIKV / Ren est dérivé d&#39;une souche sauvage de CHIKV et doit donc être manipulé dans un environnement BSL3. Les plaques peuvent être déplacés d&#39;BSL3 à BSL1 fois substrat Renilla a été ajouté au puits de culture (voir ci-dessous). </li><li> Distribuer 50 ul de cellules non infectées, rMV2/Luc-infected, ou CHIKV / Ren-infectés dans des plaques de culture contenant des dilutions en série de composés de vie. Incuber 24 heures à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de luciole pour déterminer l&#39;activité luciférase de luciole dans des puits rMV2/Luc-infected. Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de Renilla pour déterminer l&#39;activité de la luciférase de Renilla dans CHIKV / puits Ren-infectées. Enfin, ajouter 50 ul de réactif de dosage de la viabilité en fonction de la luciférase de cellules non infectées, pour déterminer la viabilité cellulaire. </li><li> Tracer les données (Figure 4) et déterminer les concentrations de composés qui inhibent touchés MV et la réplication de CHIKV de 50%. Ne tenez pas compte composé présentant une certaine toxicité dans cet essai. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le pipeline de criblage décrit ici vise à sélectionner des composés avec un profil adapté comme inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Quand une bibliothèque de 10 000 composés a été criblée avec ce protocole et les critères de filtrage ci-dessus ont été appliquées, à savoir l&#39;inhibition de la réplication MV supérieur à 75%, 40 composés (0,4%) a reçu positif. En outre, environ la moitié d&#39;entre eux ont montré une toxicité sur dans le test de la viabilité en fonction de la ...

virus à ARN sont responsables d&#39;une grande variété d&#39;infections humaines, et avoir un impact énorme sur les populations à travers le monde à la fois en termes de santé publique et de coût économique. Vaccins efficaces ont été mis au point contre plusieurs virus à ARN humain, et sont largement utilisés comme traitements prophylactiques. Cependant, il ya encore un manque crucial de médicaments thérapeutiques contre les infections de virus à ARN. En effet, les vaccins efficaces ne sont pas disponibles par rapport aux principales agents pathogènes humains tels que le virus de la dengue, virus de l&#39;hépatite C ou le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). En outre, des virus à ARN sont responsables de la majorité des maladies émergentes, qui ont augmenté en fréquence en raison des échanges mondiaux et l&#39;impact humain sur les systèmes écologiques. Contre cette menace que représentent les virus à ARN, notre arsenal thérapeutique est très limitée et relativement inefficace 1-3. Les traitements actuels sont essentiellement basés sur le type recombinant des interférons (IFN-α / β) pour stimuler l&#39;immunité innée,ou l&#39;administration de la ribavirine. Bien que le mode d&#39;action de cette ribonucléoside analogique est controversée et s&#39;appuie sur divers mécanismes probablement, l&#39;inhibition de l&#39;IMPDH cellulaire (inosine monophosphate déshydrogénase), qui épuise les pools intracellulaires de GTP, 4 est évidemment essentiel. La ribavirine, en combinaison avec PEG-IFN-α, est le principal traitement contre le virus de l&#39;hépatite C. Cependant, les traitements IFN-α / β et ribavirine sont relativement pauvres efficacité in vivo contre la plupart des virus à ARN comme ils efficacement émoussé IFN-α / β de signalisation à travers l&#39;expression de facteurs de virulence 5 et échappent souvent à la ribavirine 3. Ceci ajouté au fait que le traitement de la ribavirine soulève des questions de toxicité importants, mais il a récemment été approuvé contre la maladie de hRSV sévère avec avantages controversés 6. Plus récemment, certains traitements spécifiques du virus ont été commercialisés, en particulier contre le virus de la grippe avec le développement odes inhibiteurs de la neuraminidase f 3. Cependant, la grande diversité et l&#39;émergence permanente de virus à ARN empêche le développement de traitements spécifiques contre chacun d&#39;eux dans un avenir relativement proche. Au total, ce insiste sur la nécessité de stratégies efficaces pour identifier et développer des molécules antivirales puissantes dans un proche avenir. Il est trivial de dire que un inhibiteur à large spectre actif contre un large panel de virus à ARN permettrait de résoudre ce problème. Même si une telle molécule est toujours le rêve d&#39;un virologue, notre meilleure compréhension des mécanismes de défense cellulaire et le système immunitaire inné suggèrent que des possibilités existent 7,8. Plusieurs laboratoires académiques et industriels cherchent maintenant des molécules qui stimulent des aspects spécifiques des mécanismes de défense cellulaire ou des voies métaboliques à émousser la réplication virale. Bien que ces composés seront probablement montrer des effets secondaires importants, les traitements contre les infections virales aiguës seront administrered pour un temps relativement court, ce qui les rend acceptable malgré une certaine toxicité potentielle sur le long terme. Diverses stratégies ont été développées pour identifier ces large spectre des molécules antivirales. Certains programmes de recherche visent à trouver des molécules qui ciblent les voies spécifiques de la défense ou métaboliques. Cela comprend, par exemple, récepteurs de reconnaissance de l&#39;agent pathogène à susciter l&#39;expression des gènes antiviraux 9 et activer des facteurs antiviraux tels que RNaseL 10, les machines de autophagy pour promouvoir la dégradation des virus 11, à la synthèse de nucléoside parcours d&#39;accompagnement 12,13, ou cascades apoptotiques pour précipiter la mort de cellules infectées par des virus 14. D&#39;autres groupes ont développé des écrans phénotypiques qui ne sont pas fondées, cibler 13,15-17. Dans ce cas, des molécules antivirales sont simplement identifiés par leur capacité à bloquer la replication virale dans un système cellulaire donné. L&#39;hypothèse générale est que un composé inhibant 2-3 virus à ARN indépendants aurait un profil adapté pour un large spectrum molécule antivirale. Le mode d&#39;action des composés de vie choisis avec une telle approche empirique n&#39;est déterminé dans un second temps et finalement, peut conduire à l&#39;identification de cibles cellulaires nouvelles d&#39;antiviraux. Fait intéressant, une analyse rétrospective des nouveaux médicaments approuvés par la US Food and Drug Administration entre 1999 et 2008 a montré que, en général, ces projections phénotypiques ont tendance à mieux performer que les approches fondées sur des objectifs à découvrir des médicaments à petites molécules de première en classe 18 . La réplication virale dans les tests cellulaires à haut débit est généralement déterminée à partir de virus effets cytopathiques. Les cellules sont infectées et cultivées dans des 96 - ou des plaques à 384 puits en présence des composés testés. Après quelques jours, les couches cellulaires sont fixées et colorées avec des colorants tels que le violet de cristal. Enfin, l&#39;absorbance est mesurée avec un lecteur de plaques et de composés inhibiteurs de la replication virale sont identifiés par leur capacité à conserver des couches cellulaires from induite par le virus effet cytopathique. Alternativement, un effet cytopathogène viral-médiation sont évalués en utilisant des analyses de viabilité standard telles que la réduction MTS. De tels dosages sont très maniable et rentable, mais souffrent de trois limites majeures. D&#39;abord, ils exigent une combinaison virus-cellule, la réplication virale est cytopathique en seulement quelques jours, mais ce n&#39;est pas toujours possible, appelant ainsi à 19 autres approches. Deuxièmement, ils sont mal quantitative car elles sont fondées sur une mesure indirecte de la réplication virale. Enfin, les composés toxiques peuvent être marqués comme résultats positifs, et doivent donc être éliminées avec un écran de mesure contre la viabilité cellulaire. Pour surmonter certains de ces obstacles, des virus ou des réplicons recombinants ont été conçus par génétique inverse pour exprimer des protéines rapporteurs, tels que la EGFP ou la luciférase, à partir d&#39;une unité de transcription supplémentaire ou dans le cadre avec des gènes de protéines virales (quelques exemples 20-23). Lorsque ces virus se répliquent, journaliste proteins sont produites conjointement avec des protéines virales eux-mêmes. Ceci permet d&#39;obtenir un dosage très quantitative pour mesurer la replication virale et à évaluer l&#39;activité inhibitrice des molécules candidates. Cela est particulièrement vrai pour les virus recombinants exprimant la luciférase (ou d&#39;autres enzymes capables de bioluminescence) puisque ce système rapporteur présente une large gamme dynamique avec une haute sensibilité et pratiquement pas de fond. En outre, il n&#39;y a pas de source de lumière d&#39;excitation, empêchant ainsi l&#39;interférence avec le composé 24 fluorescence. Ici, nous détaillons un protocole haut débit pour cribler des bibliothèques chimiques pour les inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Les composés sont testés en premier sur les cellules humaines infectées par un virus recombinant de la rougeole (MV) exprimant la luciférase de luciole 25 (rMV2/Luc, figure 1, l&#39;écran primaire). MV appartient à Mononegavirales ordre, et est souvent considéré comme un membre prototypique de virus à ARN négatifes. En tant que tel, génome MV est utilisée comme matrice par la polymerase virale de synthétiser des molécules d&#39;ARNm codant pour les protéines virales. Dans la souche MV recombinant appelé rMV2/Luc, expression de la luciférase est exprimée à partir d&#39;une unité de transcription additionnelle insérée entre les gènes P et M (figure 2A). En parallèle, les composés sont testés pour leur toxicité sur des cellules humaines en utilisant un réactif à base de luciférase-commercial qui évalue, par quantification de l&#39;ATP, le nombre de cellules métaboliquement actives en culture (figure 1, l&#39;écran primaire). Bibliothèques chimiques entiers peuvent être facilement sélectionnés avec ces deux tests afin de sélectionner des composés qui ne sont pas toxiques et qui bloquent efficacement la réplication MV. Ensuite, les coups sont à nouveau testés pour l&#39;inhibition dose-réponse de la réplication MV, l&#39;absence de toxicité ainsi que pour leur capacité à nuire à virus chikungunya (CHIKV) réplication (figure 1, l&#39;écran secondaire). CHIKV est un membre de la famille des Togaviridae, et son génome est apositive molécule d&#39;ARN simple brin. En tant que tel, il est complètement étranger à la rougeole et des composés inhibant la fois MV et CHIKV une grande chance pour inhiber un large panel de virus à ARN. Les protéines non structurales CHIKV sont directement traduits à partir du génome viral, alors que les protéines structurales sont codées par transcription et traduction d&#39;une molécule d&#39;ARNm sub-génomique. Notre test in vitro de la réplication de CHIKV est basé sur une souche recombinante appelée CHIKV / Ren, qui exprime la luciférase de Renilla enzyme comme une partie séparée par clivage de la polyprotéine non structurale par le biais d&#39;une insertion du gène rapporteur entre nsP3 et séquences nsP4 26 (figure 2B). La mesure de l&#39;activité de la luciférase de Renilla permet le contrôle de la réplication virale, au stade précoce du cycle de vie CHIKV. Ce protocole à haut débit a été utilisé pour identifier rapidement des composés avec un profil adapté pour antiviraux à large spectre dans une bibliothèque commerciale de 10 000 molecdules enrichie de la diversité chimique. Les composés ont été essentiellement suivent la règle de Lipinski de cinq ans, avec des poids moléculaires allant de 250 à 600 daltons, et valeurs du log D en dessous de 5. Plupart de ces molécules sont de nouvelles entités chimiques ne sont pas disponibles dans d&#39;autres bibliothèques commerciales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

virus à ARN sont responsables de maladies humaines majeures telles que la grippe, la bronchite, la dengue, l&#39;hépatite C ou la rougeole. Ils représentent aussi une menace émergente en raison de l&#39;augmentation des échanges à travers le monde et les populations humaines pénétrant écosystèmes de plus en plus naturelles. Un bon exemple d&#39;une telle situation émergente est épidémies de virus du chikungunya de 2005-2006 dans l&#39;océan Indien. Les progrès récents dans notre compréhension des voies cellulaires contrôlant la réplication virale suggèrent que des composés ciblant les fonctions de la cellule hôte, plutôt que le virus lui-même, pourraient inhiber un large panel de virus à ARN. Certains composés antiviraux à large spectre ont été identifiés avec accueil tests et ciblées. Toutefois, la mesure de l&#39;inhibition de la réplication virale dans des cultures de cellules en utilisant la réduction de l&#39;effet cytopathogène comme une visualisation représente encore une stratégie de dépistage primordiale. Ces écrans fonctionnels ont été grandement améliorées par le développement des virus recombinants exprimant journaliste enzymes capable de bioluminescence tel que la luciférase. Dans le présent rapport, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit, qui combine recombinant de la rougeole et les virus de chikungunya avec des tests de viabilité cellulaire, pour identifier des composés avec un profil antivirale à large spectre.

Ce pipeline de dépistage repose d&#39;abord sur la sélection de composés qui inhibent la réplication MV et ne présentent pas de toxicité cellulaire significative (figure 1, l&#39;écran principal). Il tire parti des dosages à base de luciférase pour déterminer la toxicité cellulaire et l&#39;inhibition de la réplication virale. Toutes les étapes de pipetage et d&#39;acquisition des données peut être effectué dans un cadre de haut-débit avec une plate-forme robotique. <p class="jove_c...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d&#39;autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K vues.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d'autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Recherche

Immunologie et infection

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...