The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

NOTE: Ce protocole peut être utilisé pour de multiples applications telles que la quantification de la phagocytose et l&#39;actine polymérisation utilisé dans notre travail déjà publié 12. Le protocole se prête à une grande variété de modification, et les types et les particules cellulaires Le tableau 1 énumère utilisé avec succès dans des études antérieures. Utilisation standard de ce protocole pour la quantification de la phagocytose ou actine polymérisation est illustré dans le schéma 1. <img alt="Schéma 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Schéma 1:. Schéma de dosage fluorométrique pour la quantification de la phagocytose et la polymérisation de l&#39;actine Après que les cellules sont étalées, traitées et laissées à adhérer, les particules marquées avec la fluorescence verte (FITC) sont ajoutés aux cellules pour la phagocytose. La réaction est arrêtée par trypan ou Antibiotique lavage (pour éliminer les particules non intériorisé) et la fixation est réalisée avec 4% de paraformaldehyde. Les cellules sont ensuite colorées avec étiquette rouge fluorescent de l&#39;actine (rhodamine phalloïdine) et marqueur fluorescent bleu (DAPI). Indices de la phagocytose et la polymérisation de l&#39;actine sont quantifiés comme un rapport de unités de fluorescence relative de vert / bleu (FITC / DAPI), ou / bleu (rhodamine / DAPI) fluorescence rouge. 1. Placage et le traitement des cellules REMARQUE: Avant de commencer, songez à exécuter les traitements avec au moins quatre répétitions techniques, et comprennent les commandes suivantes dans le plan de plaque: cellules seulement (sans tache, avec DAPI seul ou seule la rhodamine) et particules seulement. <ol><li> Mener toutes ajout de réactifs dans les étapes 1 à 4 dans une hotte de culture cellulaire stérile afin de protéger les échantillons de la contamination. </li><li> macrophages des plaques (de lignée cellulaire J774 murine) dans une plaque à 96 puits à 1-5 x 10 4 cellules dans 50 ul (par puits)<html> des médias complété préchauffé. Plaques Idéal pour cette méthode sont des plaques à 96 puits noires à fond transparent ou noir, selon les capacités de lecture. <ol><li> Pour des milieux complétés, utiliser 10% de FBS inactivé par la chaleur pour éviter toute interférence de cascade du complément, et 1% de pénicilline / streptomycine (si on ne utilise pour la phagocytose des bactéries vivantes). Si l&#39;aide de cellules adhérentes permettent 1-2 heures pour l&#39;adhésion, et pour les cellules non-adhérentes, centrifuger la plaque avec des cellules pendant 10 min à 500 x g. </li></ol></li><li> Ajouter agonistes / antagonistes désirés ou le contrôle du véhicule à une concentration 2x (remises en suspension dans du PBS ou de préférence, dans un milieu supplémenté) dans 50 ul pour un volume final de 100 ul (1 x) et incuber pendant une durée désirée. Pipette multicanaux et réservoirs pour réactifs seront faciliter le traitement rapide. </li></ol> 2. L&#39;opsonisation des particules fluorescentes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Types cellulaires testés et les particules fluorescentes dans l&#39;analyse fluorimétrique de la phagocytose et la polymérisation de l&#39;actine Le tableau 1 illustre des combinaisons de types de cellules (lignées cellulaires et des cellules primaires) que notre groupe a utilisé par la méthode fluorométrique: Tableau 1.. En dehors de la recherche à la phagocytose et la polymérisation de l&#39;actine de cellules de type sauvage, nous avons également utilisé une partie de ces particules à l&#39;examen de la phagocytose par les cellules transfectées exprimant une GFP (protéine fluorescente verte). La fluorescence des cellules transfectées avec des plasmides contenant reporters fluorescents peut également être utilisé en tant que marqueur cellulaire en plus de DAPI légende du tableau:. A - polymérisation de l&#39;actine; P - la phagocytose; PT - la phagocytose par les cellules transfectées GFP étiqueté; OPDex - opsonisé cordon dextran; HKOP - tués par la chaleur opsonisé. <ol><li> Veiller à ce que les particules et les marqueurs fluorescents sont protégés de la lumière en tout temps, during traitement, le lavage, ainsi que pendant l&#39;incubation afin d&#39;éviter photoblanchiment <ol><li> Pour les particules sèches, peser opsonisées (HKOP) bactéries de chaleur fluorescente tués (E2861: E. coli K-12 souche), en utilisant les spécifications du fabricant. Prenez soin de se assurer que les comptes de masse pour les 10: 1-20: 1 bactéries: ratio de cellule (ou au moins un ratio de 10: 1 - couramment utilisé dans la quantification de la phagocytose) 13,14. Nombre de particules peut être fournie par le fabricant ou déterminée par couting dilutions en série de 1 mg / ml de solution de stock. </li><li> Remettre en suspension dans 50 pi de PBS et le vortex pendant 1 minute à réglage le plus élevé. Assurer vortex bon (ici et dans le protocole) que les particules ont tendance à se agréger ce qui peut affecter l&#39;efficacité du opsonisation. </li><li> Pour les particules en suspension telles perles de dextrane comme marquées par fluorescence (perles DEX), vortex la solution mère pendant 1 min, prendre 50 pi de suspension ou en fonction de la concentration de billes dans le volume déterminer montage de perles pour faciliter 10: 1 rapport bille: cellule. </li></ol></li><li> Ajouter un volume égal de réactif de l&#39;opsonisation de particules et vortexer vigoureusement pendant une minute. </li><li> Incuber opsonisation des particules avec le réactif à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après l&#39;incubation, centrifuger les particules pendant 5 min à 500 g, et retirez le supernant réactif contenant opsonisante excès. Laver les particules par addition de 100 ul de PBS, vortex pour remettre en suspension le culot, et centrifugée pendant 5 minutes à 500 x g. <ol><li> Répétez ces étapes deux fois pour assurer opsonisation et l&#39;élimination des anticorps non lié bon. </li></ol></li><li> Préparer la solution de travail de particules opsonisées en les remettant en suspension dans 5 ml de milieu (suffisant pour une plaque de 96 puits) et à ranger de la lumière jusqu&#39;à l&#39;addition aux cellules. </li></ol> 3. La phagocytose <ol><li> Placer la solution de travail de particules dans un réservoir de réactif stérile. De là, ajouter 5056; l de particules opsonisées aux cellules préparée à l&#39;étape 1 (pour une concentration finale de 50 ng / ml) et de permettre la phagocytose de se produire dans des conditions de culture cellulaire standard. Illustrés ci-dessous sont deux méthodes de phagocytose qui peuvent être évalués en utilisant cette méthode (schéma 2). </li></ol><img alt="Schéma 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Schéma 2:. Comparaison des continu ou synchroniser phagocytose phagocytose continu indique internalisation continu de particules dans le temps comme ils atteignent lentement les cellules sur le fond du puits. Une étape de synchronisation contrastées (de centrifugation) force les particules à se enfoncer vers le bas, améliorant le contact des particules avec la cellule, et conduit à l&#39;internalisation par les cellules immédiat. Phagocytose synchronisée est un processus rapide qui intériorise plus rapidement partieicles dues à l&#39;augmentation de la cellule: le contact de particules. <ol><li><ol><li> Pour la méthode de la phagocytose continu (schéma 2) qui permettent aux cellules à phagocyter continu bactéries opsonisées comme elles se enfoncent lentement vers le bas et viennent en contact avec les cellules, utilisent des délais plus longs pour permettre aux bactéries d&#39;atteindre le fond du puits et d&#39;obtenir en toucher avec les cellules. Si la réalisation d&#39;une expérience timecourse, ajouter des bactéries à différents intervalles de temps et d&#39;arrêter la totalité de la plaque de réactions à la fois d&#39;améliorer la vitesse de traitement. </li><li> Pour la méthode synchronisée de phagocytose (schéma 2) qui améliore particules: contact cellulaire par centrifugation, centrifuger la plaque entière contenant des cellules et des particules (5 min à 500 g) dès que les particules sont ajoutés, pour faciliter la synchronisation de tous les points de temps et d&#39;accélérer la particule: l&#39;interaction cellulaire. <ol><li> Mesurer le cours du temps à partir juste après l&#39;achèvement de la centriétape de fugation. Si la réalisation d&#39;une expérience de cours de temps, arrêtez chaque point dans le temps indépendamment à différents intervalles de temps, comme décrit ci-dessous. </li></ol></li></ol></li></ol> REMARQUE: La méthode de la phagocytose synchronisée est un peu plus laborieux de la précédente, mais fournit indice phagocytaire élevée dans un temps plus court. 4. Arrêt phagocytose <ol><li> Pour les cellules adhérentes, éliminer le surnageant et ajouter 50 ul de bleu trypan dilué avec PBS (dilution 1: 2), afin d&#39;éteindre la fluorescence des bactéries non-intériorisé. </li><li> Pour les cellules non-adhérentes, tourner sur la plaque et retirez surnageant. Ajouter 50 ul de bleu trypan dilué. Assurez-vous de centrifuger la plaque au (5-10 min à 500 g) entre chaque lavage afin de minimiser la perte de cellules et permettre un lavage adéquat. </li><li> Après incubation trypan, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer toute trypan résiduelle (jusqu&#39;à ce que le PBS retiré du puits se avère clair). Trypan a été montré pour étancher 15,16 fluorescence de particules bactériennes tuées à la chaleur non internalisés marqué par fluorescence, mais pas pour les bactéries vivantes ou des billes OPDex. Pour des bactéries vivantes, y compris un lavage avec des antibiotiques tels que la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine ou le lavage au lieu de trypan pour éviter les effets de confusion de fluorescence à partir de particules non-internalisé. </li><li> Fixer les cellules avec 100 pi de paraformaldehyde à 4%, et incuber pendant 15 min à température ambiante, puis laver avec du PBS (à 100 pi par puits pour chaque lavage). À cette étape, enregistrer les cellules à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine, ou passer directement aux taches et à la quantification. NOTE: Toutes les étapes ultérieures forment ce point préface peut être fait à l&#39;extérieur de la hotte de culture cellulaire. </li><li> Retirer tout le liquide et ajouter 50 ul de DAPI à 5 ng / ml reconstituées dans du PBS. Autoriser 5 min pour la coloration, puis laver deux fois avec PBS. Après l&#39;étape de lavage, ajouter 50 pi de PBS à chaque phagocytose bien et enregistrement. </li&gt; </ol> 5. Actin Staining NOTE: En plus de la phagocytose, la méthode fluorométrique permettra la quantification de polymérisation de l&#39;actine par l&#39;intensité de l&#39;actine, qui est réduite au cours de l&#39;inhibition de lamellipodes, pseudopodiae de mesure, et la membrane de fronçage à la suite d&#39;un traitement avec un inhibiteur (figure 1A). Ce est une étape facultative Si vous êtes intéressé dans la quantification de polymérisation de l&#39;actine en plus à la phagocytose. Si polymérisation de l&#39;actine est le but final, en utilisant des particules fluorescentes pour la phagocytose est facultative. <ol><li> Après la fixation de paraformaldéhyde (étape 4.3), laver la plaque deux fois avec PBS à 100 pi par puits pour chaque lavage. Ajouter 50 ul de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation et incuber pendant -5 min à température ambiante. </li><li> Laver 0,1% de Triton X-100 2 fois avec du PBS (voir plus haut), et bloquer avec 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pendant 20 minutes pour éviter la liaison non spécifique de l&#39;Elbel. </li><li> Après blocage, retirez la solution BSA et ajouter immédiatement rhodamine phalloïdine. Pour préparer la solution de travail de la rhodamine tache, utiliser 100 pi de solution méthanoïque (fourni par le fabricant) dans 5 ml de PBS (suffisant pour une plaque). De la solution de travail ajouter 50 ul par puits et incuber pendant 20 min à température ambiante. NOTE: Après les étapes de lavage et coloration DAPI comme dans l&#39;étape 4.4 cellules sera prêt pour la quantification. </li></ol> 6. Quantification <ol><li> Pour quantifier la phagocytose utilisant un lecteur de plaque fluorescente, fiche fluorescence verte en utilisant un filtre d&#39;excitation à λ = 488 nm et un filtre d&#39;émission à fluorescence λ = 518 nm, et bleu en utilisant un filtre d&#39;excitation à λ = 355 nm et un filtre d&#39;émission à λ = 460 nm. </li><li> Pour quantifier la polymérisation de l&#39;actine en utilisant un lecteur de plaque fluorescente, fluorescence bleue enregistrement via λ = 355 nm et λ = 460 nm (comme ci-dessus), et rouge grippeorescence via le filtre d&#39;excitation à λ = 584 nm et un filtre d&#39;émission λ = 620 nm. REMARQUE: Orbital ou la détection centrale est acceptable pour l&#39;enregistrement. Certains types de cellules se rassemblent plus au bord du puits que le centre, dans ce cas, l&#39;enregistrement orbital peut être avantageux. En particulier, la moyenne de trois points autour de l&#39;orbite peut aussi être utilisée pour obtenir des résultats plus précis. </li><li> Divisez la RFU total de fluorescence verte ou rouge par fluorescence lecture bleu (de DAPI), en fonction de l&#39;étiquette de particules ou phagocytaire vs actine quantification (schéma 1). Grâce à une forte variance plaque à la plaque, utiliser les index relatifs (tels que par rapport à t = 0 commande), pour illustrer mieux les tendances observées et de faciliter l&#39;analyse statistique plus fiable. </li></ol>

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N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. 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The authors have no competing financial interests.

Les principales limites de la technique fluorométrique sont variance expérimentale ainsi que la perte de cellules associé à un lavage extensif et l&#39;utilisation de cellules non adhérentes. La variance est observée principalement en raison de la variation de particules fluorescentes que la pesée et pipetage lors de la préparation de la solution mère ne est pas une manière exacte de maintenir numéros identiques de particules d&#39;une expérience à. Pour résoudre le problème d...

La quantification de signal fluorescent a été largement utilisé dans une multitude de méthodes scientifiques allant de PCR, cytométrie en flux, la microscopie confocale, et l&#39;analyse FRET à multiplexer ELISA. imagerie de fluorescence et la quantification a une application large et peut être un excellent outil pour l&#39;analyse quantitative de divers processus cellulaires. L&#39;utilisation de marqueurs fluorescents et leur signal a été révolutionné dans la dernière décennie, et l&#39;émergence des lecteurs de plaques à fluorescence a facilité la quantification à haut débit de la fluorescence émise lors de processus cellulaires. Analyse fluorométrique peut servir comme un excellent outil pour la quantification de la phagocytose. Phagocytose a été étudié depuis la découverte des phagocytes par Metchnikoff en 1800 1. Au fil des ans, une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner cet important processus essentiel pour la défense immunitaire innée contre l&#39;invasion bactérienne, virale, fongique et les agents pathogènes parasitaires 2-5. Les méthodes antérieures de quantification utilisé la microscopie et techniques stéréologiques afin de visualiser les cellules qui sont phagocytose, qui ont ensuite été quantifiés par comptage des particules internalisées (manuellement ou avec l&#39;utilisation de logiciels) 6-8. Certains inconvénients à utiliser la microscopie seule pour l&#39;analyse quantitative sont que le comptage manuel des bactéries est beaucoup de travail et plus enclins à biais de l&#39;observateur. Une autre méthode utilisée dans la quantification de la phagocytose est la technique de placage microbiologique des bactéries à partir de lysats cellulaires (ci-après phagocytose) sur des plaques de culture bactérienne, mais cette méthode peut ne pas tenir compte des mécanismes bactéricides et la présence de bactéries internalisées partiellement. Cette méthode est encore plus de main-d&#39;œuvre par rapport à la microscopie et prend plusieurs jours à analyser. Débit semble cytométrie être le moyen le plus rapide, le plus efficace pour quantifier la phagocytose et a été utilisé par de nombreux groupes de 9 à 11, mais le coût élevé généralement associé avec le auinstrument nécessaire pour l&#39;analyse rend le procédé plus coûteux, par rapport aux tests mentionnés précédemment. La méthode fluorométrique est une bonne alternative à la cytométrie en flux pour l&#39;analyse de l&#39;internalisation de particules, car il offre la quantification objective de l&#39;équipement de fluorescence à l&#39;aide qui ne est pas que le coût prohibitif. Autres avantages supplémentaires de fluorométrie sont à haute efficacité, et les capacités à haut débit permettant de quantifier la fluorescence émise par les particules internalisées étiquetés. Avantages de fluorométrie peuvent être extrapolés à la quantification des processus autres que la phagocytose. Par exemple, l&#39;analyse fluorométrique peut être appliqué à étudier tout processus conduisant à des changements dans l&#39;expression des récepteurs intracellulaires ou membranaires, les changements dans la perméabilité cellulaire / viabilité, l&#39;efficacité de transfection, et la modulation dans la polymérisation de l&#39;actine. Un inconvénient de la technique fluorométrique est que, selon les étiquettes utilisées, il peut y avoir une forteune expérience à la variabilité qui peut habituellement être résolu en démontrant données par quantification relative, comme le changement de pli ou pour cent d&#39;augmentation du contrôle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

Le but de l&#39;analyse fluorométrique est de servir en tant que, rentable, à haut débit méthode efficace d&#39;analyse de la phagocytose et d&#39;autres processus cellulaires. Cette technique peut être utilisée sur une variété de types cellulaires, aussi bien adhérentes et non adhérentes, pour examiner diverses propriétés cellulaires. Lorsque l&#39;on étudie la phagocytose, la technique fluorométrique utilise des types de cellules phagocytaires telles que les macrophages et les particules marquées par fluorescence opsonisées dont la fluorescence peut être éteint en présence de bleu trypan. Après plaquage des macrophages adhérentes dans des plaques à 96 puits, particules fluorescentes (vert ou rouge) sont administrés et les cellules sont autorisés à phagocyter pour des montants variés de temps. À la suite de l&#39;internalisation des particules fluorescentes, les cellules sont lavées avec du bleu trypan, ce qui facilite l&#39;extinction de signal fluorescent à partir de bactéries qui ne sont pas internalisées, ou sont simplement adhérant à la surface des cellules. Après le lavage de trypan, les cellules sont lavées avec du PBS, fixés, une colorées avec DAPI (label bleu fluorescent nucléaire), qui sert à étiqueter les noyaux des cellules. Par une quantification fluorométrique simples grâce à la lecture de la plaque de l&#39;énergie nucléaire (bleu) ou de particules (/ vert rouge) fluorescence nous pouvons examiner le rapport des unités de fluorescence relative de vert: bleu et de déterminer un indice phagocytaire indicatif de quantité de bactéries fluorescentes intériorisées par cellule. La durée de l&#39;essai en utilisant un procédé et multicanaux à 96 puits pour le lavage des pipettes, de la fin de la phagocytose à la fin de l&#39;acquisition de données, est inférieur à 45 min. La cytométrie en flux peut être utilisé d&#39;une manière similaire, mais l&#39;avantage de la fluorométrie est son débit élevé, méthode rapide d&#39;évaluation avec un minimum de manipulation d&#39;échantillons et la quantification rapide de l&#39;intensité de fluorescence par cellule. Des stratégies similaires peuvent être appliqués à des cellules non adhérentes, des bactéries vivantes, marqués polymérisation de l&#39;actine, et essentiellement tout procédé utilisant la fluorescence. Par conséquent, fluorométrie est une méthode prometteuse pour son faible coût, haute throughpcapacités ut dans l&#39;étude des processus cellulaires.

Deux grands moyens de quantifier la phagocytose et la polymérisation de l&#39;actine ultérieure grâce à l&#39;utilisation de ce protocole est d&#39;observer la phagocytose continu ou synchronisé. L&#39;analyse microscopique (figure 1B) illustre images fluorescentes comparables à ce que le fluoromètre enregistre (voir aussi le diagramme 1). Dans la figure 1B sont fluorescence rouge de l&#39;actine, vert 268 fluorescence du FITC étique...

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Haut Débit Fluorometric Technique pour l&#39;évaluation de phagocytose des macrophages et l&#39;actine polymérisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K vues.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Acellulaire biochimique dosage fluorimétrique pour haut débit mesure de peroxydation des lipides dans les lipoprotéines de haute densité

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

Évaluation in vivo de l'efférocytose du macrophage alvéolif après l'exposition à l'ozone

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.