Ce protocole permet de mesurer la capacité des anticorps à opsoniser et induire la phagocytose des érythrocytes infectés par le plasmodium falciparum. Les anticorps présents dans le sérum des individus naturellement exposés à l’infection parasitaire, ainsi que ceux induits par la vaccination par des antigènes parasites, peuvent être testés. Maiken Visti, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.
Pour mettre en place une culture cellulaire THP-1 pour un essai de phagocytose, la veille de l’expérience semer les cellules dans un flacon de culture carré de 25 centimètres et une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans THP un milieu de culture cellulaire. Le jour de l’expérience, au moins une heure avant le bloc d’expérience à fond rond 96-puits plaques avec 150 microlitres de stérile 2%FBS dans PBS par puits. Pour la récolte et la purification des érythrocytes infectés par les trophozoites à un stade intermédiaire ou avancé, préparez environ 1,2 millilitres de culture de parasites P falciparum emballés dans 10 millilitres de milieu de culture parasitaire, avec au moins 5 % de parasitemie et ajoutez à une colonne magnétique.
Lavez la colonne avec 50 millilitres de milieu de culture parasitaire. Pour éliminer les érythrocytes infectés, retirez la colonne de l’aimant et rincez-la avec 50 millilitres de milieu de culture parasitaire. Ensuite, recueillir les érythrocytes infectés par centrifugation et resuspendre la pastille dans un millilitre de milieu de culture parasite frais pour le comptage.
Ajuster la suspension purifiée des érythrocytes infectés de 3,3 fois 10 à la septième cellule par millilitre dans le milieu de culture des parasites contenant du bromure d’éthidium, à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Ensuite, retirez la solution de blocage d’une plaque de 96 puits en faisant glisser la plaque dans un conteneur à déchets. Retirez ensuite tout excès sur une serviette en papier et ajoutez 30 microlitres de la suspension érythrocyte infectée par l’étiquette de bromure d’érythrocyte à tous sauf un puits dans la moitié supérieure de la plaque.
Ajouter 30 microlitres de culture parasitaire moyenne au puits vide, et incuber la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, ajouter 170 microlitres de milieu de culture parasitaire à chaque puits et sédimenter les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Enlevez le supernatant en faisant glisser la plaque dans un récipient à déchets, et lavez les érythrocytes infectés étiquetés au bromure d’éthidium deux fois de plus, avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits, comme nous venons de le démontrer.
Après le deuxième lavage, utiliser une pipette multicanal pour enlever soigneusement tout le volume de supernatant de chaque puits, sans déranger les granulés. Et résuspendez les érythrocytes infectés étiquetés au bromure d’éthidium dans 30 microlitres de solution d’anticorps, y compris les contrôles appropriés et les échantillons d’essai précédemment préparés dans le milieu de culture de parasite. Ensuite, placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes, à l’abri de la lumière.
Pendant que les érythrocytes infectés sont opsonisés, recueillez les cellules THP-1 par centrifugation, et réutilisez la pastille en 12 millilitres de milieu de culture cellulaire THP-1 frais préchauffé. Après une deuxième centrifugation, resuspendez la pastille dans un millilitre de milieu de culture cellulaire THP-1 pour le comptage, et ajustez la concentration cellulaire à cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le milieu de culture cellulaire THP-1. Retirez la solution de blocage de la deuxième plaque de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de cellules THP-1 à chaque puits.
Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation de l’opsonisation, ajouter 170 microlitres de milieu de culture parasitaire à chaque puits de la plaque d’opsonisation, et sédimenter les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Lavez les érythrocytes infectés opsonisés deux fois avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits, à l’aide d’une pipette multicanal pour enlever soigneusement le supernatant après le deuxième lavage.
Resuspendez les érythrocytes infectés opsonisés dans 100 microlitres du milieu préchauffé de culture cellulaire de THP-1 par puits, et transférez 50 microlitres de chaque suspension infectée opsonisée d’érythrocyte à un puits correspondant dans la plaque de phagocytose. Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au plus 40 minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêter la phagocytose par centrifugation à quatre degrés Celsius.
Retirer le supernatant et réutiliser les granulés avec 150 microlitres de solution de lysage au chlorure d’ammonium à température ambiante par puits. Après exactement trois minutes, ajouter 100 microlitres de froid glacial à 2%FBS dans PBS pour arrêter la lyse, et sédimenter les cellules intactes par centrifugation. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de glace fraîche froide 2%FBS en PBS par puits, par lavage.
Après le lavage final, resuspendez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de glace fraîche froide 2%FBS en PBS par puits. Pour l’acquisition et l’analyse de cytométrie d’écoulement, chargez immédiatement les cellules sur un cytomètre d’écoulement et utilisez la parcelle linéaire de dispersion latérale avant contre linéaire pour les puits sans érythrocytes infectés pour portailr les cellules THP-1. Acquérir 10 000 événements dans cette porte, et utiliser les cellules THP-1 avec les érythrocytes infectés opsonisés avec un contrôle positif pour mettre en place une parcelle d’histogramme pour mesurer l’intensité de fluorescence de bromure d’éthidium.
Pour analyse, ouvrez la parcelle linéaire de dispersion latérale vers l’avant par rapport à la parcelle linéaire de dispersion pour les puits sans érythrocytes infectés, et portez les cellules THP-1. Ensuite, installez une porte positive dans un histogramme FL-3 et copiez ces portes sur tous les autres puits d’échantillon pour déterminer le pourcentage de cellules THP-1 positives au bromure d’éthidium. Pour chaque échantillon testé, la phagocytose peut être déclarée comme valeur absolue ou comme phagocytose relative calculée en pourcentage en utilisant le contrôle positif comme maximum.
Les cellules THP-1 doivent être vérifiées périodiquement pour l’expression de surface des récepteurs gamma FC par cytométrie d’écoulement. Les cellules doivent être négatives pour le CD16, et positives pour le CD32 et le CD64. Dans cette expérience d’opsonisation, les cellules THP-1 ont été gated d’abord selon leurs profils avant et latéraux de dispersion, pour permettre la quantification du pourcentage de cellules ethidium bromure-étiquetées, indicatif des cellules qui ont phagocytized au moins un érythrocyte infecté opsonized d’anticorps.
Les échantillons témoins négatifs devraient tous générer un pic négatif unique dans le canal FL3, avec peu d’événements observés dans le marqueur de bromure d’éthidium. Par conséquent, les valeurs moyennes de phagocytose, à la fois en tant que cellules THP-1 absolues de bromure bromure-positive et en tant que pourcentages relatifs de phagocytose, devraient être très basses. En revanche, le contrôle positif devrait générer des traces avec deux pics, un pic négatif et un pic clairement positif et bien séparé situé dans le marqueur de bromure d’éthidium.
Les valeurs moyennes de phagocytose sont normalement les plus élevées pour la lutte positive, suivies par le bassin féminin exposé au paludisme et les témoins féminins exposés au paludisme. Bien que cette méthodologie génère des résultats cohérents, des écarts dans le coefficient de pente des lignes ajustées ont été observés. Par conséquent, l’utilisation de valeurs relatives est recommandée, surtout s’il n’est pas possible d’exécuter tous les échantillons en une seule expérience.
Assurez-vous de planifier soigneusement l’expérience à l’avance, en préparant à la fois les cellules THP-1 et les parasites en conséquence, en utilisant uniquement des trophocytes d’une pureté supérieure à 80%En outre, assurez-vous d’inclure toujours les contrôles appropriés, pour permettre à la qualité de l’expérience d’être évaluée et faciliter l’analyse des données.
