Ce travail a été soutenu financièrement par la Communauté européenne (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), l’Agence Nationale de Recherche, le Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), et la Région Nord Pas de Calais. Nous remercions Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni et Frank Lafont de la plateforme BICeL pour leur assistance technique.

1. Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Criblage effectué dans une lignée cellulaire humaine de pneumocytes de type II modèle A549 lors de l’infection par Mtb H37Rv exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Cette procédure est décrite à la figure 1A.
<ol><li>Remettre en suspension la bibliothèque d’ARNsi séchés qui est stockée dans des plaques mères (plaques de 96 puits) avec 1x tampon d’ARNsi pour atteindre une concentration de 4 μM, puis transférer 10 μl du mélange dans une plaque fille de 384 puits (plaque fille 1).</li>
	<li>Ajouter 10 μl de tampon d’ARNsi 1x dans la plaque fille 1 pour diluer l’ARNsi par 2 fois. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.</li>
	<li>Diluer les siARN de la plaque fille 1 en plaque fille 2 pour atteindre une concentration de 500 nM. Après la remise en suspension de l’ARNsi, les plaques sont scellées avec un joint en aluminium pelable et peuvent être stockées à -20 ° C au moins 6 mois et jusqu’à 2-3 ans, mais le temps de stockage peut varier en fonction des recommandations du fabricant de la bibliothèque siRNA.</li>
	<li>Avant utilisation, décongeler la plaque fille 2 à température ambiante.</li>
	<li>Prendre 2,5 μl d’ARNsi de la plaque fille 2 et placer dans une plaque d’analyse à 384 puits.</li>
	<li>Dans la même plaque d’analyse de 384 puits à l’étape 1.5, ajouter 2,5 μl d’ARNsi témoin négatif et positif à leurs puits respectifs.</li>
	<li>Diluer le réactif de transfection dans 1x D-PBS pour donner suffisamment de solution pour fournir 0,1 μl de réactif de transfection dans chaque puits et pré-incuber la solution de transfection diluée à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 7,5 μl du mélange réactif de transfection/solution PBS à chaque puits de la plaque d’essai et incuber pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 40 μl de cellules A549 (1 500 cellules/puits) en suspension dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF). Maintenir les cellules pendant une période d’incubation de 3 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Ces cellules se divisent toutes les 24 heures, soit environ 12 000 cellules se trouvent dans les puits trois jours après la transfection.</li>
	<li>Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x. (Pour des conditions de culture deGFP-Mtb H37Rv voir le Protocole 3).</li>
	<li>Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.</li>
	<li>Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (LA600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer la concentration bactérienne. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience sur une autre culture qui avait été préparée dans les mêmes conditions. Préparer une suspension bactérienne contenant 2,4 x 106 bactéries/ml, ce qui correspond à une multiplicité d’infection (MOI) de 5.</li>
	<li>Retirer le milieu dans la plaque d’analyse de 384 puits et ajouter 25 μl de suspension bactérienne fraîchement préparée.</li>
	<li>Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 heures dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.</li>
	<li>Retirez le milieu et lavez doucement les cellules avec un milieu RPMI complété par 10% FBS 3x.</li>
	<li>Pour tuer les bactéries extracellulaires restantes, traiter les cellules avec 50 μl de milieu RPMI-FBS frais contenant 50 μg/ml d’amikacine à 37 °C pendant 1 h dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.</li>
	<li>Retirer l’amikacine contenant du milieu et ajouter 50 μl de milieu RPMI frais complété par 10 % de FBS. Incuber la plaque d’analyse à 384 puits à 37 °C pendant 5 jours dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.</li>
	<li>Avant l’acquisition de l’image, ajouter 10 μl de 30 μg/ml de DAPI fraîchement préparés dans du PBS (concentration finale de 5 μg/ml) et incuber pendant 10 min à 37 °C.</li>
	<li>Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence DAPI à l’aide d’un laser d’excitation 405 nm avec filtre d’émission de 450 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 1.20 et 1.21, puis exécutez l’acquisition automatique. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Transférer des images vers un serveur distant. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter les noyaux cellulaires du canal DAPI à l’aide de l’algorithme de détection des noyaux et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels (Figure 4A).</li>
</ol>Remarque: Ce protocole est optimisé pour étudier l’effet du silençage génique sur la croissance intracellulaire de Mtb. Le VTT est une bactérie à croissance lente qui se divise toutes les 20 heures dans des conditions optimales. Après 5 jours post-infection, la quantité de VTT extracellulaire est encore faible en l’absence de lyse cellulaire et n’a pas affecté la qualité de l’analyse. Ce protocole doit être optimisé en termes de durée de traitement antibiotique et de temps d’incubation pour être adapté aux criblages siRNA utilisant des bactéries à croissance rapide comme Mycobacteria smegmatis et Escherichia coli qui sont largement libérées et peuvent infecter de nouvelles cellules.
2. Criblage composé à haut débit
Dépistage effectué sur des cellules hôtes infectées par Mtb H37Rv. Cette procédure est décrite à la figure 1B.
<ol><li>Décongeler les plaques mères de 384 puits contenant la bibliothèque composée solubilisée dans le DMSO à 100%. Transférer 0,5 μl des composés dans des plaques filles de 384 puits contenant 10 μl de milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS.</li>
	<li>Laver une culture Mtb H37Rv exprimant le GFP de deux semaines avec du D-PBS (exempt de MgCl2 et CaCl2)par centrifugation à 4 000 x g pendant 5 min et jeter les lavages. Répétez cette étape 3x (pour les conditions de cultureGFP-Mtb H37Rv voir protocole 3).</li>
	<li>Suspendre le culot bactérien dans 10 ml de milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS et décanter pendant 1 heure à température ambiante pour permettre aux agrégats bactériens de sédimenter.</li>
	<li>Recueillir le surnageant bactérien et mesurer la DO600 (DO600 doit être comprise entre 0,6 et 0,8) et la fluorescence GFP (valeur RFU) à l’aide d’un lecteur de microplaque. Calculer le titre de la suspension à l’aide d’une droite de régression de référence affichant la valeur RFU = f (valeur CFU) qui avait été générée avant l’expérience. La concentration typique est de 1 x 108 bactéries/ml.</li>
	<li>Récoltez des macrophages humains primaires âgés de 6 jours à 4 x 105 cellules/ml dans le milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant (pour la purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain et la différenciation des macrophages, voir le protocole 4).</li>
	<li>Incuber les cellules primaires diluées avec des bacilles à différents MOI, allant de 1 à 5, en suspension avec des secousses légères à 90 rpm pendant 2 heures à 37 °C.</li>
	<li>Laver les cellules infectées par centrifugation à 350 x g pour éliminer les bactéries extracellulaires. Après chaque étape de centrifugation, ressusciter la pastille dans un milieu RPMI 1640 complété par 10% de FBS. Répétez cette étape 2x.</li>
	<li>Suspendre les cellules infectées dans le milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS et d’amikacine à 50 μg/ml et incuber la suspension avec des secousses légères pendant 1 h à 37 °C.</li>
	<li>Retirer le milieu de culture cellulaire contenant de l’amikacine par centrifugation à 350 x g et laver les cellules infectées avec un milieu RPMI 1640 complet complété par 10 % de FBS et 50 ng/ml de M-CSF humain recombinant. Répétez une fois.</li>
	<li>Ajouter 40 μl de la suspension de macrophages infectés dans la même plaque d’essai à l’étape 2.1, qui contient déjà 10 μl des dilutions composées. La concentration finale de DMSO dans chaque puits a maintenant atteint 1%.</li>
	<li>Incuber les plaques d’essai pendant 5 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2.</li>
	<li>Colorer les cellules vivantes avec un colorant fluorescent rouge lointain perméant.</li>
	<li>Chargez la plaque dans un microscope confocal automatisé. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Définissez les paramètres d’exposition. Enregistrer la fluorescence rouge lointain à l’aide d’un laser d’excitation 640 nm avec filtre d’émission de 690 nm et la fluorescence GFP à l’aide d’un laser d’excitation de 488 nm avec filtre d’émission de 520 nm. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Sélectionnez les puits et les champs de chaque puits à acquérir, ce qui est ensuite appelé paramètres de mise en page et de sous-disposition. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Générez le fichier d’expérience à l’aide des paramètres des étapes 2.14 et 2.15 et exécutez l’acquisition automatique. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Transférer des images vers un serveur distant. <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a></li>
	<li>Évaluer les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Détecter la zone cellulaire du canal rouge lointain à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels et la zone bactérienne du canal GFP à l’aide de l’algorithme des propriétés d’intensité des pixels(Figure 4B).</li>
</ol>Remarque : Ce protocole peut être adapté pour le criblage de la bibliothèque mutante Mtb en remplaçant les composés par des mutants exprimant une protéine fluorescente (Un puits/Un mutant) (Figure 1C, voir aussi Brodin et al. 4). Les mutants fluorescents sont d’abord ensemencés dans des puits (20 μl de suspension bactérienne par puits). Les bactéries sont ensuite récupérées par 30 μl de suspension cellulaire. Après centrifugation à 350 x g pendant 1 min, la plaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2. Le temps d’incubation et le MOI dépendent du test. Par exemple, pour la visualisation des premiers événements cellulaires tels que l’acidification des phagosomes, les cellules peuvent être infectées pendant 2 heures avec moi allant de 1-20. Les lysosomes sont colorés à l’aide du colorant Lysotracker à 2 μM pendant 1,5 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % deCO2, puis fixés avec 10 % de forcine ou 4 % de paraformaldéhyde (PFA). Les images confocales sont acquises et finalement analysées à l’aide de scripts d’analyse d’images comportant des algorithmes appropriés pour la détection des lysosomes et la localisation subcellulaire4.
3. Protéine fluorescente verte exprimant mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Conditions de culture
Pour le stockage à long terme, les GFP-H37Rv ont été congelés dans du D-PBS (environ 1 x10 8 mycobactéries par flacon).
<ol><li>Résurciez un flacon congelé de GFP-H37Rv dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 50 ml de bouillon 7H9 additionnés d’enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, de glycérol à 0,5 %, de Tween-80 à 0,05 % et d’hygromycine B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incuber 8 jours à 37 °C.</li>
	<li>Mesurer laDO 600 de la culture GFP-H37Rv.</li>
	<li>Diluer la culture GFP-H37Rv pour obtenirla DO 600 = 0,1 dans un bouillon 7H9 frais complété par un enrichissement en OADC de Middlebrook à 10 %, du glycérol à 0,5 %, du tween-80 à 0,05 % et de l’hygromycine B (50 μg/ml).</li>
	<li>Incuber le GFP-H37Rv à 37 °C pendant 8 jours de plus avant de l’utiliser pour le dosage.</li>
</ol>4. Purification des cellules monocytaires du sang périphérique humain à partir de la préparation de sang total ou de buffy-coat
<ol><li>Diluer la poche sanguine 2x dans 1x D-PBS (exempt deMgCl2 et CaCl2)contenant 1% fbs.</li>
	<li>Isoler les monocytes par centrifugation de gradient de densité de Ficoll à 400 x g pendant 20 min.</li>
	<li>Recueillir les monocytes isolés.</li>
	<li>Laver les monocytes 3x avec 1x D-PBS (exempt deMgCl2 etCaCl2)contenant 1% de FBS par centrifugation à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Concentrer les cellules jusqu’à 1 x 107 cellules/ml.</li>
	<li>Purifier les monocytes à l’aide de billes magnétiques CD14 selon le protocole du fabricant (voir Matériaux).</li>
	<li>Après purification des cd14-monocytes, ensemencer les cellules à 1,5 x10 6 cellules/ml dans RPMI 1640 complété par 10% FBS et 40 ng/ml de macrophages humains Colony Stimulating Factor (hM-CSF) et incubés pendant 4 jours à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.</li>
	<li>Après 4 jours, remplacer le milieu par du RPMI 1640 frais complété par 10% de FBS et 40 ng/ml de hM-CSF et incubé pendant 2 jours à 37°C dans une atmosphère contenant 5% deCO2.</li>
	<li>Après 6 jours, les cellules peuvent être utilisées pour le test.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gandhi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-resistant+and+extensively+drug-resistant+tuberculosis:+a+threat+to+global+control+of+tuberculosis.">Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis.</a> Lancet. 375, 1830-1843 (2010).</li><li>Barry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+latent+tuberculosis:+rethinking+the+biology+and+intervention+strategies.">The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).</li><li>Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis-infected+macrophages:+an+in+vitro+model+for+tuberculosis+drug+discovery.">High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery.</a> Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).</li><li>Brodin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+phenotypic+cell-based+visual+screen+identifies+Mycobacterium+tuberculosis+acyltrehalose-containing+glycolipids+involved+in+phagosome+remodeling.">High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Bermudez, L. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages:+a+case+study+for+optimization+procedure.">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).</li><li>Song, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal-based+method+for+quantification+of+diffusion+kinetics+in+microwell+plates+and+its+application+for+identifying+a+rapid+mixing+method+for+high-content/throughput+screening.">Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Nous décrivons ici les méthodes requises pour un essai phénotypique utilisant une contrainte de Mtb H37Rv exprimant GFP pour infecter les cellules hôtes fluorescentement étiquetées, ce qui le rend approprié pour des écrans à haute teneur/à haut débit. Ce protocole pourrait être appliqué à un large éventail de composés, de sondes fluorescentes et de mutants Mtb. Pour chaque protocole décrit ci-dessus, des étapes de fixation et d’immunomarquage pourraient être effectuées avant l’ac...

Parmi les agents pathogènes infectieux émergents et réémergents signalés au cours des dernières années, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)occupe une place de choix en étant responsable de 1,4 million de décès et de 8,7 millions de nouvelles infections en 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Malgré la disponibilité de thérapies multidrogues, le nombre de personnes infectées est toujours en hausse et multirésistante (MDR) ainsi que le Mtb très résistant aux médicaments (XDR) se propagent rapidement dans le monde entier1. De plus, si l’on tient compte de la présence d’antigènes Mtb, il est évident qu’un tiers de la population mondiale est considéré comme étant infecté de manière latente par Mtb. Statistiquement, dans un cas sur dix, il y a évolution vers la forme active de la maladie avec les symptômes cliniques suivants2. Par conséquent, de nouveaux moyens de lutter contre le VTT sont nécessaires de toute urgence. Dans ce contexte, nous avons développé un test phénotypique visuel in vitro s’appuyant sur la surveillance de l’invasion et de la multiplication du Mtb dans les cellules hôtes par microscopie confocale automatisée à fluorescence3. L’adaptation du test dans des plaques de microtitration de 384 puits en combinaison avec l’acquisition et l’analyse automatisées d’images, a permis un criblage à haute teneur / haut débit (HC / HTS) de bibliothèques à moyenne échelle de composés, de siARN et de mutants bactériens. Le criblage d’une bibliothèque d’ARNi à l’échelle du génome sur ce dosage phénotypique a ainsi permis d’identifier les principaux facteurs hôtes impliqués dans le trafic de Mtb et la réplication intracellulaire mais aussi l’élucidation des voies de l’hôte exploitées par le bacille tuberculeux. Une autre adaptation de ce test phénotypique particulier était pour l’identification des facteurs bactériens essentiels à la persistance intra-phosomique de Mtb. Par exemple, l’arrêt de la maturation du phagosome est considéré comme l’un des principaux mécanismes qui facilitent la survie et la réplication du Mtb dans les macrophages. La surveillance de la localisation subcellulaire des mutants knock-out Mtb dans les compartiments acides marqués par fluorescence a permis d’identifier les gènes bactériens impliqués dans le processus de survie4. Enfin, l’imagerie à haute teneur de Mtb offre également une excellente méthode pour quantifier l’efficacité des médicaments pour inhiber divers phénomènes tels que la croissance bactérienne intracellulaire3. Au total, ce type de dosage phénotypique à haut débit permet d’accélérer la découverte de médicaments contre la tuberculose et les données collectées par ces différentes approches contribuent à une meilleure compréhension de la manipulation de l’hôte exercée par Mtb.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1010">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#181;clear-plate black, 384 well</td>
			<td style="width:160px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:175px;">781091</td>
			<td style="width:388px;">127.8/86/15 MM with Lid, TC treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CellCarrier 384 well plate</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;">6007550</td>
			<td>Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">V-bottom white , 384 well-plate</td>
			<td style="width:160px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:175px;">781280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">sealing tape, breathable, sterile</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">3345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">13778150</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">34943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">61870-010</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">14190-094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Salin Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">14190-091</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Salin Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">2610040-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td style="width:160px;">DUTSCHER</td>
			<td style="width:175px;">17-1440-03</td>
			<td>Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-050-201</td>
			<td>Purification of CD14+ Monocytes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Human M-CSF, premium gr. (1000 &#956;g)</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-096-493</td>
			<td>Macrophage Colony Stimulating Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS Columns</td>
			<td style="width:160px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:175px;">130-042-401</td>
			<td>Columns for CD14+ Monocytes isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tween 80</td>
			<td style="width:160px;">Euromedex</td>
			<td style="width:175px;">2002-A</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Glycerol high purity </td>
			<td style="width:160px;">Euromedex</td>
			<td style="width:175px;">50405-EX</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;"> Middlebrook OADC enrichment</td>
			<td style="width:160px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:175px;">211886</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7H9</td>
			<td style="width:160px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:175px;">W1701P</td>
			<td>Mycobacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Versene 1X</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">15040033</td>
			<td>Non enzymatic cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DAPI</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">D1306</td>
			<td>Nuclei dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">H3570</td>
			<td>Nuclei dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syto60</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">S11342</td>
			<td>Nuclei/cytoplasm dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formalin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">HT5014</td>
			<td>Cell fixation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siRNA targeting Dectin-1</td>
			<td style="width:160px;">Santa-Cruz</td>
			<td style="width:175px;">sc-63276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">*siGenome* Non targeted siRNA pool </td>
			<td style="width:160px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:175px;">D-001206-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">R3501</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Isoniazid (INH)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">I3377-50G</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:175px;">10687-010</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Amikacin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1774</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Automated Confocal Microscope OPERA</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Columbus 2.3.1 Server Database</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Data transfert, storage and analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acapella 2.6 software</td>
			<td style="width:160px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Image-based analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GraphPad Prism5 software</td>
			<td style="width:160px;">GraphPad </td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:287px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:160px;">Microsoft</td>
			<td style="width:175px;"> </td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening

Malgré la disponibilité du traitement et du vaccin, la tuberculose (TB) reste l’une des infections bactériennes les plus mortelles et les plus répandues dans le monde. Depuis plusieurs décennies, l’explosion soudaine de souches multirésistantes et largement résistantes aux médicaments constitue une menace sérieuse pour le contrôle de la tuberculose. Par conséquent, il est essentiel d’identifier de nouvelles cibles et voies critiques pour l’agent causal de la tuberculose, Mycobacterium tuberculosis (Mtb)et de rechercher de nouveaux produits chimiques qui pourraient devenir des médicaments antituberculeux. Une approche consiste à mettre en place des méthodes adaptées aux écrans génétiques et chimiques des bibliothèques à grande échelle permettant la recherche d’une aiguille dans une botte de foin. À cette fin, nous avons développé un test phénotypique en nous appuyant sur la détection de Mtb marqué par fluorescence dans les cellules hôtes marqués par fluorescence à l’aide de la microscopie confocale automatisée. Ce test in vitro permet une quantification basée sur l’image du processus de colonisation de Mtb dans l’hôte et a été optimisé pour le format de microplaque de 384 puits, qui convient aux cribles de siRNA, de composé chimique ou de Mtb mutant-bibliothèques. Les images sont ensuite traitées pour l’analyse multiparamétrique, qui fournit la lecture inférer sur la pathogénie de Mtb dans les cellules hôtes.

Criblage à haut débit de l’ARNsi à l’échelle du génome
Mtb est capable de coloniser les cellules immunitaires in vitro ainsi que plusieurs autres cellules épithéliales pulmonaires. Par exemple, Mtbest capable d’infecter et d’endommager les cellules épithéliales A549 qui sont couramment utilisées comme modèle pour les pneumocytes humains de type II5-7. Dectin-1 a été rapporté comme un récepteur de la cellule hôte impliqué dans l’abso...

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A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

a-microscopic-phenotypic-assay-for-quantification-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.6K vues.  Université de Lille. Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Vidéo: A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Recherche

Immunologie et infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not associated with the protein in nature. Literature has provided numerous examples regarding the implementation of directed evolution to successfully alter molecular specificity and catalysis1. The primary advantage of utilizing directed evolution instead of more rational-based approaches for molecular engineering relates to the volume and diversity of variants that can be screened2. One possible application of directed evolution involves improving structural stability of bacteriolytic enzymes, such as endolysins. Bacteriophage encode and express endolysins to hydrolyze a critical covalent bond in the peptidoglycan (i.e. cell wall) of bacteria, resulting in host cell lysis and liberation of progeny virions. Notably, these enzymes possess the ability to extrinsically induce lysis to susceptible bacteria in the absence of phage and furthermore have been validated both in vitro and in vivo for their therapeutic potential3-5. The subject of our directed evolution study involves the PlyC endolysin, which is composed of PlyCA and PlyCB subunits6. When purified and added extrinsically, the PlyC holoenzyme lyses group A streptococci (GAS) as well as other streptococcal groups in a matter of seconds and furthermore has been validated in vivo against GAS7. Significantly, monitoring residual enzyme kinetics after elevated temperature incubation provides distinct evidence that PlyC loses lytic activity abruptly at 45 &deg;C, suggesting a short therapeutic shelf life, which may limit additional development of this enzyme. Further studies reveal the lack of thermal stability is only observed for the PlyCA subunit, whereas the PlyCB subunit is stable up to ~90 &deg;C (unpublished observation). In addition to PlyC, there are several examples in literature that describe the thermolabile nature of endolysins. For example, the Staphylococcus aureus endolysin LysK and Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 and Pal lose activity spontaneously at 42 &deg;C, 43.5 &deg;C and 50.2 &deg;C, respectively8-10. According to the Arrhenius equation, which relates the rate of a chemical reaction to the temperature present in the particular system, an increase in thermostability will correlate with an increase in shelf life expectancy11. Toward this end, directed evolution has been shown to be a useful tool for altering the thermal activity of various molecules in nature, but never has this particular technology been exploited successfully for the study of bacteriolytic enzymes. Likewise, successful accounts of progressing the structural stability of this particular class of antimicrobials altogether are nonexistent. In this video, we employ a novel methodology that uses an error-prone DNA polymerase followed by an optimized screening process using a 96 well microtiter plate format to identify mutations to the PlyCA subunit of the PlyC streptococcal endolysin that correlate to an increase in enzyme kinetic stability (Figure 1). Results after just one round of random mutagenesis suggest the methodology is generating PlyC variants that retain more than twice the residual activity when compared to wild-type (WT) PlyC after elevated temperature treatment.

A novel directed evolution method specific to the field of thermostability engineering was developed and consequently validated for bacteriolytic enzymes. After only one round of random mutagenesis, an evolved bacteriolytic enzyme, PlyC 29C3, displayed greater than twice the residual activity when compared to the wild-type protein after elevated temperature incubation.

Une nouvelle méthode de dépistage pour l&#39;évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...