Pour commencer, cultivez les cellules dans un milieu complet DMEM contenant 10 % de FBS et 5 % de pénicilline-streptomycine dans une plaque à six puits. Incuber la culture pendant une nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, co-culture des cellules avec 10 nanoparticules d’oxyde de fer modifiées à la polylysine nanomolaire ou IONP, et incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 12 heures.
Après l’incubation, ajoutez 0,5 millilitre de trypsine par puits pendant trois minutes pour digérer les cellules. Ajoutez ensuite un millilitre de Complete Medium par puits pour arrêter la digestion. Centrifuger la suspension cellulaire à 1 000 g pendant cinq minutes et jeter le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans du PBS.
Ensuite, suspendez à nouveau la pastille dans huit millilitres de solution hypotonique fraîchement préparée pendant 15 minutes. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à essai en verre et, à l’aide d’un homogénéisateur en verre, appliquez 20 chocs à 1 000 tr/min pour libérer les organites. Après homogénéisation, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Placez le tube dans un séparateur magnétique pendant une heure pour séparer complètement les endosomes chargés d’IONP des autres organites et débris cellulaires. Pour recueillir les endosomes, jetez le liquide du tube et ajoutez trois millilitres de PBS pour remettre les endosomes en suspension. Ensuite, utilisez un pistolet à pipette pour souffler afin de remettre en suspension les pastilles brunes qui se trouvent sur la surface de contact du tube à côté du cadre magnétique.
Pour une homogénéisation à grande vitesse, transférez la solution endosomique dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Placez la glacière sous le tube, puis placez le tube sur l’homogénéisateur à grande vitesse. Placez la sonde de 10 millilitres dans le tube sans toucher le fond.
Sur l’écran de l’homogénéisateur, réglez la vitesse sur 140 g et réglez l’heure sur cinq minutes. Appuyez sur le bouton OK puis sur le bouton Démarrer. Après l’homogénéisation à grande vitesse, transférez la suspension de nano-vésicules dans un tube de 1,5 millilitre et placez le tube dans un séparateur magnétique pendant une heure.
Enfin, collectez le liquide contenant les mimics d’exosomes ou EM requis sans perturber la surface à côté du cadre magnétique. La morphologie des BMSC-EMs analysées par NTA et TEM a montré une structure typique en forme de vésicule en forme de bol, délimitée par une bicouche lipidique. Les BMSC-EM et les 293T-EM avaient un diamètre hydrodynamique similaire à celui des VE natifs.
Les résultats du Western blot ont montré que les BMSC-EM contiennent les mêmes biomarqueurs protéiques que les VE et qu’ils n’ont presque pas été contaminés par la membrane plasmique. Le rendement de l’EMS était significativement plus élevé que celui des VE natifs préparés par ultracentrifugation. Les EM avaient une composition protéique similaire à celle des VE natifs.
