Commencez par mélanger la caséine, l’alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone et le BSA avec un pH sept pour préparer le tampon de dosage. Ensuite, préparez de l’immunoglobuline G de lapin à 10 % dans un tampon de dosage pour fabriquer le tampon de dilution de l’échantillon. Préparez le volume du mélange de billes de travail nécessaire pour l’essai.
Ensuite, décongelez le SARS-CoV-2 préparé et contrôlez les surnageants à quatre degrés Celsius pendant une heure. Étiquetez et disposez huit tubes microfuges de 1,5 millilitre pour le SRAS-CoV-2 et les surnageants de contrôle. Pour créer la dilution la plus élevée de chaque surnageant, combinez 600 microlitres de surnageant avec le tampon de dilution de l’échantillon dans des tubes étiquetés de manière appropriée, puis faites brièvement tourbillonner le tube pour mélanger.
Transférez séquentiellement 400 microlitres de l’un à un surnageant dilué dans le tube de dilution suivant. Vortex brièvement chaque surnageant dilué avant de procéder à la dilution suivante. Ensuite, prenez le mélange de billes de travail pré-préparé après avoir vortex pendant 30 secondes et ajoutez cinq microlitres à chaque puits attribué d’une plaque de microtitration à fond plat de 384 puits.
Ajouter 45 microlitres de dilution surnageante préparée dans les puits assignés contenant des microsphères dans la plaque à 384 puits. Scellez la plaque et incubez toute la nuit sur un agitateur orbital à 650 tr/min dans l’obscurité à température ambiante. Après avoir retiré la plaque de microtitration de l’agitateur orbital, centrifugez la plaque à 931 g pendant une minute.
Retirez ensuite la scelleuse de plaques. Pour immobiliser les billes, placez la plaque de microtitration sur un séparateur de plaques magnétiques pendant 30 secondes. Avec la plaque de microtitration toujours positionnée sur le séparateur magnétique, aspirez le surnageant des billes immobilisées par l’aimant.
Après avoir retiré la plaque de microtitration du séparateur magnétique, ajoutez 60 microlitres de PBST dans chaque puits contenant des billes. Ensuite, prenez cinq tubes de 1,5 millilitre pour préparer différents mélanges de détection. Ajoutez à chaque tube un anticorps monoclonal humain anti-S1 et des fragments variables à chaîne unique marqués FLAG ciblant la protéine de pointe sur la particule du SRAS-CoV-2.
Ajoutez 50 microlitres par puits du mélange approprié de détection de pointes à chaîne unique, spécifique à un fragment variable, aux microsphères lavées. Scellez la plaque de microtitration et incubez comme indiqué précédemment. Ensuite, centrifugez la plaque de microtitration.
Laver trois fois l’excès de réactif de détection de pointes des billes avec 60 microlitres de PBST. Ensuite, préparez une solution fluorescente composée d’immunoglobuline G anti-humaine conjuguée au PE et de violet brillant pour 21 anticorps anti-FLAG conjugués. Ajoutez 50 microlitres par puits de mélange de solution fluorescente aux microsphères lavées et incubez comme indiqué précédemment.
Faites ensuite tourner la plaque de microtitration. Lavez l’excès de mélange de solution fluorescente des microsphères avec 60 microlitres de PBST. Suspendez les microsphères dans 60 microlitres de PBST dès la dernière étape de lavage.
Analysez ensuite la plaque sur un système d’analyse de flux à double rapporteur avec les réglages souhaités. Dans la dilution des surnageants cellulaires infectés par le SRAS-CoV-2 dans les deux canaux rapporteurs, un signal dépendant de la concentration a été observé. Trois des cinq fragments variables à chaîne unique peuvent détecter le virus dans une dilution aussi faible que de un à 18.
Pour les deux fragments variables à chaîne unique restants, le virus est détectable dans des dilutions aussi faibles que un à six.
