Pour commencer, mettez en suspension les cellules musculaires squelettiques isolées de souris blessées par la notexine marquées à l’iododésoxyuridine dans un millilitre de DMEM sans sérum froid et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Sous une hotte, ajoutez du bouillon de cisplatine pour obtenir une concentration finale de 25 micromolaires. Agitez le tube pendant 10 secondes et incubez à température ambiante pendant une minute.
Éteignez la réaction avec du DMEM glacé contenant 10% FBS et placez-le sur de la glace. Après avoir granulé et remis en suspension les cellules, filtrez la suspension à travers une crépine de cellule de 35 micromètres. Sous une hotte, ajoutez une solution mère de paraformaldéhyde filtrée pour fixer la suspension cellulaire et le vortex pendant 30 secondes.
Lavez-le deux fois avec deux millilitres de milieu de coloration cellulaire ou CSM par centrifugation. Après le lavage final, aspirez le surnageant à environ 60 microlitres et remettez complètement le granulé en suspension. Ajoutez 40 microlitres de mélange de coloration d’anticorps de surface 2,5 fois préparé dans le CSM et incubez pendant une heure tout en les vortex toutes les 20 minutes.
Après avoir lavé l’échantillon deux fois avec du CSM, aspirez le surnageant et agitez la pastille. Pour perméabiliser les cellules, sous une hotte, ajoutez 0,5 millilitre de méthanol glacé goutte à goutte tout en vortexant. Laver les cellules deux fois avec un millilitre de CSM par centrifugation.
Après le dernier lavage, aspirez le surnageant à environ 60 microlitres et remettez complètement le granulé en suspension. Incuber les cellules avec 40 microlitres de mélange de coloration d’anticorps intracellulaires pendant une heure, tout en vortex les échantillons toutes les 20 minutes. Après avoir lavé les cellules deux fois avec un millilitre de CSM, remettre les échantillons en suspension dans 0,5 millilitre de la solution d’iridium intercalateur et vortex.
