Pour commencer, prenez les cellules musculaires squelettiques colorées avec du cisplatine, des anticorps conjugués au métal et une solution d’intercalateur-iridium, et granulez les cellules par centrifugation. Une fois le surnageant éliminé, ajoutez un millilitre de CSM dans les cellules vortexées. Granulez les cellules par centrifugation et lavez-les dans un millilitre de tampon CAS.
Après la centrifugation, aspirez le surnageant à environ 200 microlitres. Ajoutez un millilitre de tampon CAS aux échantillons vortex et aliquotez cinq microlitres pour le comptage des cellules. Après avoir centrifugé les cellules et aspiré le surnageant à 50 microlitres, remettre les cellules en suspension dans le tampon CAS jusqu’à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre et ajouter des billes d’étalonnage pour obtenir une concentration finale de 0,1x.
Chargez l’échantillon dans le cytomètre de masse pour collecter des données à l’aide d’un débit de 400 à 500 cellules par seconde, et normalisez les données après la collecte. Si nécessaire, concaténez les fichiers individuels de l’étalon de cytométrie en flux ou FCS pour chaque échantillon en un seul fichier. Identifiez les cellules uniques en tenant compte des événements positifs à l’intercalateur d’iridium.
Sélectionnez les événements qui sont négatifs pour le cisplatine à la porte pour les cellules vivantes. Identifiez la population d’intérêt et quantifiez la proportion relative de cellules souches et de cellules progénitrices. Pour effectuer une analyse de grande dimension, exportez la population d’intérêt et utilisez des algorithmes de clustering.
Pour l’analyse X-shift, téléchargez le progiciel Vortex et Java 64 bits. Téléchargez les populations de cellules exportées dans une base de données locale et définissez les paramètres de clustering. Pour visualiser les relations spatiales entre les populations de cellules au sein des clusters X-shift, effectuez une mise en page dirigée par la force.
L’analyse CyTOF a identifié une séquence de quatre populations, de cellules souches et de populations progénitrices de un à trois. Les populations progénitrices P1 et P2 correspondent à des cellules progénitrices de plus en plus matures. La P3 a déjà été identifiée, mais n’a pas été caractérisée en raison de sa faible abondance.
La dynamique des cellules souches et des cellules progénitrices après la lésion a été analysée à l’aide de CD9 par CD104 par des diagrammes à points axiaux. Une augmentation notable de la population de cellules souches a été observée le troisième jour, suggérant une expansion. Cela a été soutenu par une incorporation accrue d’iododésoxyuridine, indiquant une prolifération cellulaire, et une expression accrue de MyoD, comme le montre la superposition de couleurs.
Des cellules souches activées marquées par des niveaux élevés de CD98, CD44, MyoD et iododésoxyuridine ont été identifiées, soulignant leur forte prolifération et leur état activé au troisième jour après la blessure.
