Pour commencer, placez la souris femelle expérimentale sur une plate-forme de travail. Par voie intrapéritonéale, administrez 7,5 unités internationales de gonadotrophine sérique de jument gestante vers 20h00 le premier jour. Après 48 heures, injecter par voie intrapéritonéale 7,5 unités internationales de gonadotrophine chorionique humaine.
Divisez le couvercle d’une boîte de culture cellulaire en moitiés supérieure et inférieure. Dans la moitié supérieure, placez quatre à six gouttelettes de cinq microlitres chacune de PVP pour le placement des spermatozoïdes. Ajoutez 8 à 10 gouttelettes de cinq microlitres chacune de milieu M2 dans la moitié inférieure pour la procédure ICSI.
Couvrez les gouttelettes PVP et M2 moyennes avec environ trois millilitres d’huile minérale. Après avoir isolé la queue épididymaire de la souris mâle euthanasiée, épongez-la doucement sur de la gaze stérilisée. Ouvrez la queue de l’épididyme et pressez doucement, à l’aide d’une pince, pour libérer les spermatozoïdes, en les recueillant dans des tubes de liquide tubaire humain pré-équilibrés.
Rincez la queue de l’épididyme dans le milieu liquide tubulaire humain préchauffé. Placez le tube découvert à 37 degrés Celsius et l’incubateur à 5% de dioxyde de carbone pour la capacité des spermatozoïdes. Le quatrième jour après l’injection de gonadotrophine chorionique humaine, placez la souris femelle euthanasiée sous un microscope à dissection.
À l’aide d’une aiguille de calibre 25, déchirez l’ampoule de l’oviducte pour libérer de nombreux complexes ovocytaires de cumulus. Après la capacitation, sonicez 100 microlitres de spermatozoïdes pendant cinq secondes pour séparer la tête de la queue. Remplissez l’aiguille de micromanipulation avec le liquide opératoire, en vous assurant que la partie remplie mesure 0,5 centimètre à l’intérieur de l’aiguille.
Installez l’aiguille sur le bras droit du micromanipulateur et fixez-la en serrant le capuchon de maintien. Installez ensuite une pipette de maintien de micromanipulation à pointe plate sur le bras gauche du micromanipulateur. Positionnez l’aiguille d’injection et la pipette de maintien dans le champ de vision du microscope.
À l’aide d’un microscope à polarisation, déterminer la position du fuseau de métaphase dans l’ovocyte pour s’assurer que l’appareil du fuseau n’est pas du côté de l’injection. Au contact de l’aiguille d’injection avec la zone pellucide, activez des impulsions piézoélectriques d’une intensité de cinq et d’une fréquence de un, créant une perforation dans la zone pellucide et permettant à l’aiguille d’injection de passer à travers. À l’aide d’impulsions piézoélectriques d’intensité un et de fréquence un, créez un petit pore dans la membrane plasmique, en veillant à ce que la tête du spermatozoïde soit injectée dans l’ooplasme.
À l’aide d’une pince atraumatique, extériorisez soigneusement les ovaires, les oviductes et l’utérus de la souris femelle pseudo-enceinte anesthésiée. Faites une petite incision inclinée vers le haut à l’aide de la pointe d’une aiguille de seringue sur la paroi utérine sous la jonction utérotubaire, en évitant les vaisseaux sanguins. Insérez doucement l’oviducte de deux à trois millimètres à travers le petit trou.
En utilisant la méthode ICSI, un taux de fécondation de 89,57 % a été atteint chez la souris, avec 87,38 % des zygotes progressant vers le stade embryonnaire à 2 cellules dans les 24 heures suivant l’ICSI. Le taux de naissance de petits vivants après le transfert d’embryons a été observé à 42,5 %. Cependant, les souris ICSI mâles présentaient systématiquement des taux élevés de glucose sanguin à jeun, ce qui suggère une altération de l’homéostasie du glucose.
Dans les tests de tolérance au glucose, des différences significatives dans les niveaux de glucose dans le sang ont été notées entre l’ICSI mâle et les souris témoins, tandis qu’aucune différence n’a été observée chez les souris femelles. Dans le suivi du poids corporel, les souris ICSI mâles et femelles ont présenté un phénotype de surpoids par rapport aux témoins.
