L’injection ronde de spermatides peut résoudre le problème de la reproduction chez certains patients atteints d’azoospermie non obstructive, mais son efficacité est très faible. Notre étude a utilisé des souris comme modèles pour rechercher des méthodes permettant d’améliorer l’efficacité du développement embryonnaire de ROSI chez la souris. Des statistiques incomplètes indiquent que moins de 200 fœtus humains conçus par ROSI ont été mis au monde dans le monde.
Un tournant dans la compréhension du potentiel de la technologie ROSI s’est produit en 2015, lorsque Tanaka et ses collègues ont rapporté les naissances réussies de 14 fœtus grâce à la technologie ROSI, instillant une confiance renouvelée dans son application clinique et sa faisabilité. La recherche ROSI se concentre actuellement sur les anomalies dans les modifications épigénétiques et l’activation anormale assistée par les ovocytes, tandis que l’identification précise des données de spermatozoïdes ronds est également un défi. L’efficacité de développement des embryons ROSI chez la souris est déjà très élevée dans notre laboratoire, qui est similaire à d’autres laboratoires.
Cependant, l’efficacité du développement des non-rongeurs, comme des humains, est encore très nouvelle. À l’avenir, nous nous concentrerons sur l’amélioration de l’efficacité du développement des non-rongeurs. Pour commencer, injectez à une souris femelle âgée de six à huit semaines par voie intrapéritonéale 7,5 unités internationales chacune de gonadotrophine sérique de jument gravide à 17h00 et de gonadotrophine chorionique humaine 48 heures plus tard.
Assurez-vous qu’aucun contact avec des souris mâles n’a lieu après l’injection. Après avoir euthanasié la souris, ouvrez sa cavité abdominale. À l’aide de ciseaux, sectionnez les trompes de Fallope près des deux ovaires et placez-les dans un tampon M2 préchauffé à 37 degrés Celsius.
Sous l’objectif 10X d’un microscope vertical, localisez la partie transparente et agrandie de la trompe de Fallope. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, fixez la trompe de Fallope, coupez la partie élargie et collectez les complexes coronaux coronaux de l’ovocyte. Pour éliminer les cellules de la granulosa, placez le complexe ovocytaire dans une solution opératoire M2 préchauffée contenant 0,1 % d’hyaluronidase, et soufflez doucement à travers une pipette buccale.
Transférez l’ovocyte en série dans des gouttelettes de KSOMaa pour les rincer trois fois, puis placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Pour commencer, procurez-vous une souris mâle C57BL/6 euthanasiée âgée de huit à 10 semaines. Ouvrez sa cavité abdominale et excisez doucement l’épididyme près du testicule avec des ciseaux.
Placez la parabole contenant l’épididyme dans un milieu M2 sous l’objectif 10X d’un microscope vertical. Et à l’aide d’une seringue d’un millilitre, excisez doucement l’épididyme pour laisser les spermatozoïdes s’écouler. Siphonnez les spermatozoïdes en suspension dans le fond d’un tube contenant 0,5 millilitre de tampon M2.
Pour l’isolement des spermatides rondes, transférez le testicule disséqué dans le tampon M2. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, coupez doucement la membrane blanche au microscope, puis pressez et excisez les tubes séminifères alvéolés. Après avoir extrait la suspension, filtrez avec un tamis de 400 mailles et centrifugez les cellules filtrées.
Jetez le surnageant et incubez les cellules avec 200 microlitres de Hoechst 33342 à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez le tube de cytométrie contenant les cellules colorées dans le cytomètre en flux. Après avoir ajusté la tension, sélectionnez la population de cellules en fonction de la diffusion directe et latérale.
Ensuite, supprimez les adhérences cellulaires en fonction de la diffusion vers l’avant et de la largeur d’impulsion de déclenchement. À l’aide de deux canaux de détection sous un laser de longueur d’onde de 355 nanomètres, triez les spermatides rondes et stockez-les à quatre degrés Celsius. Au microscope, les spermatides rondes de souris mesuraient environ 10 micromètres de diamètre et présentaient une structure nucléole en forme de protubérance au milieu.
Pour commencer, obtenez des ovocytes et des spermatides rondes de souris. Ensuite, préparez les aiguilles de maintien et d’injection avec les diamètres appropriés. Placez les ovocytes en gouttelettes de 10 microlitres M2 avec ou sans cytochalasine B pour ramollir et stocker les gamètes.
Ensuite, placez les gouttelettes rondes de spermatides M2 et montez la parabole sur la table d’opération microscopique. Ajustez la position de l’injection et fixez l’aiguille. À l’aide de polyvinylpyrrolidone, ou PVP, humidifiez et nettoyez l’aiguille d’injection.
Ensuite, extrayez la spermatide ronde dans l’aiguille d’injection. Faites pivoter l’ovocyte avec l’aiguille de maintien pour orienter le corps polaire de l’ovocyte à la position 12 heures. Ensuite, placez soigneusement l’aiguille d’injection à la position trois heures sur l’ovocyte.
À l’aide d’un appareil PiezoXpert, créez un trou dans la zone pellucide des ovocytes. Ensuite, avancez doucement l’aiguille d’injection dans l’ovocyte horizontalement et rompez la membrane de l’ovocyte. Injectez progressivement la spermatide ronde dans le cytoplasme de l’ovocyte.
Retirez l’aiguille d’injection et aspirez une petite quantité de la membrane des ovocytes près de l’ouverture pour la sceller. Pour l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, placez les spermatozoïdes sur une piste PVP. Aspirez les spermatozoïdes de la queue et positionnez son cou à l’embouchure de l’aiguille d’injection.
Appliquez un piézo pour séparer la tête du spermatozoïde de la queue. Ensuite, injectez le spermatozoïde dans l’ovocyte comme démontré précédemment, avec une aiguille d’injection de neuf à 10 micromètres de diamètre. Pour une activation assistée des ovocytes, placez les ovocytes dans des gouttelettes de 20 microlitres de milieu CZB sans calcium ni magnésium contenant du chlorure de strontium hexahydraté.
Ensuite, transférez-les dans un milieu de culture KSOMaa pour la culture. Simultanément, établissez un groupe pour l’activation de la parthénogenèse sans injecter de spermatides rondes ou de spermatozoïdes pour les études embryologiques. Après activation, transfert dans le milieu de culture KSOMaa pour la culture.
Les embryons ronds injectés de spermatides ont montré une efficacité de développement réduite par rapport aux embryons injectés de spermatozoïdes intracytoplasmiques.
