Pour commencer, préparez un stock de 20 % d’acrylamide, d’urée à sept molaires et de solution 1X TBE. Pour un gel, combinez 10 millilitres de solution d’acrylamide et d’urée avec 100 microlitres de persulfate d’ammonium à 10 % et trois microlitres de tétraméthyléthylènediamine, et coulez-le dans une roulette de gel. Une fois que le gel s’est solidifié, pré-exécutez le gel dans un tampon 1X TBE pendant 30 minutes à 10 milliampères par gel avec chauffage externe.
À l’aide d’une pipette Pasteur, rincer 1X TBE dans les puits de gel pour éliminer l’excès d’urée. Chargez 10 microlitres de chaque réaction et faites fonctionner pendant une à 1,5 heure à 45 à 55 degrés Celsius. Visualisez le gel avec les bons réglages pour le fluorophore choisi.
Enfin, quantifiez l’intensité de la bande du produit et du substrat à l’aide d’ImageJ, et calculez le pourcentage du produit à l’aide de la formule. L’activité de l’ADN ligase a conduit à une augmentation de la taille des oligonucléotides de 20 à 40 nucléotides observée sur un gel d’urée PAGE. L’ADN ligase bactérien ligaturait à la fois les substrats d’ADN entaillés et non concordants et peut utiliser à la fois le magnésium et le manganèse pour l’activité de ligature avec une préférence pour le magnésium.
