L’importance de ce protocole est l’utilisation d’une nouvelle protéine fluorescente SUMO-piégeage UTAG pour la détection du modificateur de protéines SUMO dans diverses cellules eucaryotes. Le principal avantage de cette technique est un protocole simple pour la détection sans anticorps de SUMO dans une variété de cellules, y compris la culture des tissus mammifères et les 9odes nématodes. SUMO joue un rôle important dans le cancer et les troubles neurodégénératifs, ce qui souligne la nécessité d’outils robustes et fiables pour la détection et l’analyse fonctionnelle des protéines modifiées par SUMO.
Parce que SUMO est fortement conservé, la protéine UTAG fluorescente de SUMO-piégeage peut être employée pour étiqueter sumo conjugué dans beaucoup d’organismes différents. Cette vidéo démontre son utilisation dans les cellules mammifères. En outre, le texte intégral décrit son utilisation dans les ovocytes nématodes.
La démonstration visuelle de cette technique fournit des conseils critiques pour le traitement des cellules avant la coloration et la détection SUMO. Pour commencer, cultiver des cellules de culture tissulaire de choix sur des glissements ronds de couverture de 22 millimètres dans des plaques TC de six puits jusqu’à 70 à 80 % de confluent. Lavez brièvement les cellules avec un millilitre de DPBS.
Pour fixer les cellules, ajouter deux millilitres de frais 4%PFA et DPBS à chaque puits. Incuber les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les cellules fixes trois fois pendant cinq minutes dans un millilitre de DPBS tout en noix de la plaque.
Pour perméabiliser les cellules, incuber pendant 15 minutes avec 1%Triton X-100 en DPBS. Lavez les cellules à nouveau, comme avant. Incuber les cellules avec 500 microlitres de 1 molaire glycine HCL pH 2 pendant 10 secondes.
Ensuite, neutralisez immédiatement le pH avec 500 microlitres de tampon SUMO Protease 10X, ou SPB. Après avoir lavé les cellules comme avant, retirez les feuillets de couvercle du puits et placez-les dans une chambre d’humidité. Pour la coloration UTAG-FL seulement, mélanger un microgramme d’UTAG-FL avec 100 microlitres de 1X SPB contenant cinq millimolaires TCEP dans un tube.
Ensuite, pipette le mélange sur les cellules sur le bordereau de couverture et d’incuber à température ambiante pendant une heure dans la chambre d’humidité. Pour laver les feuillets de couvercle, pipette 200 microlitres de DPBS sur chaque feuillet de couvercle et laisser en place pendant 10 minutes. Répétez le lavage deux fois de plus.
Retirer les feuillets de couvercle du dernier lavage et les inverser sur une toboggan de microscopie pré-nettoyée avec une goutte de support de montage. Conservez les échantillons toute la nuit dans un congélateur de 20 degrés Celsius avant de les visualiser au microscope. Visualisez les cellules à l’aide des ensembles de filtres appropriés pour DAPI et Texas Red.
Veuillez consulter le texte intégral d’un protocole sur la façon d’étiqueter SUMO et les 9odes nématodes fixes. Bien que l’étiquetage des cellules mammifères soit assez simple, l’étiquetage des ovocytes nématodes nécessite une formation préalable sur les dissections des 9odes. KmUTAG-FL incubé avec des cellules PMT2 fixes a montré une coloration nucléaire distincte.
Des taches nucléaires diffuses et des foyers nucléaires distincts étaient visibles. La localisation nucléaire a été confirmée à l’aide de co-coloration avec DAPI. Conformément à l’activité de piégeage SUMO de KmUTAG-FL, le modèle de localisation nucléaire n’était pas sans rappeler la coloration SUMO23.
La co-coloration avec l’anticorps anti-SUMO23 8A2 a confirmé la co-localisation de KmUTAG-FL avec le signal SUMO23. Cela valide l’efficacité de KmUTAG-FL pour détecter SUMO23 dans les cellules mammifères. 9ons isolés de l’hermaphrodite adulte c productrice d’ovocytes.
les nématodes d’elegans ont été étiquetés avec l’anticorps anti-SUMO. Conformément aux rapports précédents, l’anticorps anti-SUMO initialement localisé au plasme nucléaire des ovocytes myotiques tardifs de prophase. Il a ensuite redistribué au complexe central de l’anneau des homologs appariés que l’enveloppe nucléaire est tombé en panne et les chromosomes congrès vers la plaque de métaphyse.
Dans les préparations parallèles, les 9eds étiquetés avec KmUTAG-FL ont indiqué des modèles semblables. KmUTAG-FL est passé de l’étiquetage du nucléoplasme à la concentration sur le complexe de l’anneau lorsque les ovocytes ont commencé et terminé le processus de décomposition de l’enveloppe nucléaire. Ces résultats valident KmUTAG-FL comme un outil utile pour l’analyse des processus liés à la myose et au SUMO en c.
elegans et peut-être d’autres nématodes. Lors de la fixation, il est essentiel d’utiliser du paraformaldéhyde frais et un court temps de fixation pour garder SUMO plié de façon native afin qu’il puisse être reconnu par le KmUTAG. Étant donné que la structure tertiaire de SUMO est fortement conservée, il est très probable que les variantes SUMO provenant de systèmes modèles et non modèles supplémentaires puissent être analysées avec le réaccente KmUTAG-FL.
Actuellement, nous utilisons cette nouvelle protéine fluorescente SUMO-piégeage UTAG pour étudier la fonction de SUMO pendant le stress cellulaire. Enfin, veuillez noter que toutes les étapes utilisant le paraformaldéhyde fixatif doivent être effectuées dans un capot de sécurité de laboratoire et que ce réaccente doit être éliminé correctement.
