Ce protocole offre une alternative puissante pour le dépistage de l’activité nucléase en tant que biomarqueur de la maladie, avec une méthodologie facile à mettre en œuvre, même pour les chercheurs qui ne sont pas aussi spécialisés dans les sondes d’acide nucléique. Le principal avantage de cette technique est la capacité de sélectionner des sondes d’acide nucléique qui peuvent identifier les activités nucléase connues et inconnues, en profitant de l’interaction dynamique sonde-nucléase. D’autres avantages de cette méthodologie sont sa flexibilité, sa haute reproductibilité et sa facilité d’utilisation.
La démonstration sera effectuée par Khadija, étudiante à la maîtrise, et Baris, un postdoc de notre laboratoire. Lors de la conception d’une bibliothèque d’oligonucléotide, inclure au moins un ADN et une séquence aléatoire ARN contenant une combinaison d’adénine, guanine, cytosine et thiamine ou uracil. Pour préparer les sondes oligonucléotides, faites tourner les sondes oligonucléotides lyophilisées et diluez chaque sonde dans le tampon Tris-EDTA à une concentration de 500 picomolaires par microlitre pour prévenir la dégradation des nucléases.
Pour la culture bactérienne sur le milieu solide, rouler une seule perle de verre poreuse de stockage cryogénique directement sur un plat de culture contenant TSA complété par du sang de mouton défibrinated pour strier les colonies bactériennes individuelles. Placez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour la culture bactérienne dans le milieu liquide, transférer une seule colonie d’une culture moyenne solide à 50 millilitres de BST pour incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 rotations par minute.
Le lendemain, diluer la culture à un rapport de un à 500 dans le BST frais et incuber la bactérie pendant 24 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute dans un incubateur secouant. Pour mettre en place un test d’activité nucléase, préchauffez d’abord un fluoromètre à 37 degrés Celsius et ajoutez soigneusement 96 microlitres de TSB stérile ou de supernatant provenant d’une culture moyenne liquide salmonella ou E.Coli à un tube de microcentrifugeuse sans nucléase de 1,5 millilitre par sonde. Ajoutez quatre microlitres de solution de travail de sonde à chaque tube et utilisez une pipette pour bien mélanger chaque contenu de tube jusqu’à ce que des solutions homogènes soient réalisées, en prenant soin d’éviter les bulles.
Ensuite, chargez soigneusement 95 microlitres de chaque solution près de la paroi des puits individuels d’un fond noir, plaque de puits non traitée 96, en prenant soin d’éviter les bulles. Lorsque toutes les solutions ont été ajoutées, couvrez la plaque et inspectez visuellement le couvercle pour décexer les marques de stylo ou la poussière qui peuvent introduire des artefacts de mesure. Pour configurer le logiciel de mesure de l’activité nucléase, ouvrez un logiciel d’acquisition approprié.
Sélectionnez Lire maintenant à partir de la fenêtre Gestionnaire de tâches, et sélectionnez Nouveau pour créer le protocole de mesure cinétique. Cliquez sur Définir la température pour sélectionner 37 degrés Celsius et confirmer et enregistrer les paramètres en cliquant sur OK. Cliquez sur Démarrer Kinetics. Dans la fenêtre contexturée, sélectionnez deux heures dans la boîte d’entrée Run Time et deux minutes dans la boîte d’entrée d’intervalle avant de cliquer sur OK pour confirmer et enregistrer les paramètres.
Cliquez sur Lire. Dans la fenêtre contexturée, sélectionnez l’intensité de fluorescence comme méthode de détection, endpoint cinétique comme type de lecture et filtres comme type optique. Ensuite, cliquez sur OK. Dans la fenêtre contextée, sélectionnez Vert dans l’ensemble de filtres et cliquez sur OK. Dans la fenêtre Procédure, sélectionnez Couvercle d’utilisation et cliquez sur Valider.
Une fenêtre contextée apparaîtra confirmant que le protocole créé est valide. Dans le menu Protocole, sélectionnez Procédure. Dans la fenêtre Procédure, définissez les puits à mesurer et entrez le nom de l’expérience dans la boîte d’entrée du nom du fichier.
Chargez ensuite la plaque dans le lecteur de plaque, en prenant soin que la plaque est dans la bonne orientation et cliquez sur le bouton Lire nouveau pour commencer l’acquisition. Pour l’analyse des données, ouvrez les données dans le logiciel d’analyse approprié et sélectionnez l’un des puits mesurés dans la fenêtre de la plaque. Cliquez sur Sélectionnez Puits et incluez tous les puits mesurés dans la fenêtre Dialogue de sélection des puits avant de cliquer sur OK. Sélectionnez ensuite données dans la plaque une fenêtre pour visualiser les résultats compilés et cliquez sur QuickExport pour exporter les données vers une feuille de calcul.
Dans une feuille de calcul, étiquetez les colonnes de données comme appropriées pour chaque échantillon et sonde, et tracez les unités de fluorescence relative par rapport au temps pour que les données génèrent des graphiques cinétiques. Dans cette expérience représentative, après la première série de dépistage, les supernatants de la culture Salmonella ont signalé une nette préférence pour les sondes ARN par rapport aux sondes d’ADN. Basée sur l’identification de l’ARN comme type d’acide nucléique préféré par les nucléases salmonella, une nouvelle bibliothèque à ARN seulement est conçue pour être utilisée dans la deuxième série de dépistage.
En revanche, E.Coli dans les contrôles moyens de culture a démontré une capacité très limitée de dégrader les sondes d’ARN. Après une deuxième série de criblages utilisant des nucléotides chimiquement modifiés visant à augmenter la spécificité des sondes d’ARN, la pyrimidine d’ARN 2'O-méthyl et le purine d’ARN 2'O-méthyl pourraient être identifiés sur la base de leurs modifications chimiques comme présentant le comportement cinétique le plus performant par rapport à l’ARN pyrimidine 2'fluoro et ARN purine 2'fluoro respectivement. Ces résultats suggèrent que Salmonella a une activité importante de RNAse avec la préférence différentielle de chimie de substrat qui peut être employée pour sélectionner des sondes capables de reconnaître spécifiquement cette bactérie.
Cette procédure permet la sélection de sondes capables d’identifier les activités nucléases associées à des maladies telles que le cancer ou l’infection bactérienne, permettant le développement de nouveaux outils diagnostiques cliniques.
