Pour commencer, prenez 100 milligrammes de tissu frais ou 20 milligrammes de tissu séché à l’air et placez-le dans un tube à centrifuger de deux millilitres. Placez deux billes d’acier inoxydable de cinq millimètres dans le tube de centrifugation et transférez-les dans un broyeur de tissus à haut débit fonctionnant à 60 hertz pendant 60 secondes Pour l’extraction de l’ADN, ajoutez 800 microlitres de tampon d’isolement nucléaire pré-refroidi à l’échantillon et placez-le sur un mélangeur vortex pendant cinq minutes.
Ensuite, placez l’échantillon dans une centrifugeuse et faites-le tourner à 13 780 g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant avec précaution. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de tampon P1, suivis de cinq microlitres de RNase A à l’échantillon.
Après le vortex, incubez les échantillons dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 1,5 heure, en inversant les tubes deux à trois fois pendant l’incubation. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon P2. Mélanger. Et placez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes.
Ensuite, centrifugez à 13, 780g pendant 10 minutes. Aspirez soigneusement le surnageant sur une colonne de filtre AF et centrifugez-le à 13 780 g pendant deux minutes. Transférez le filtrat inférieur dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Après avoir calculé le volume du filtrat, ajoutez 1,5 fois le volume du tampon P3 à l’échantillon et agitez immédiatement pour mélanger l’échantillon. Ajoutez 650 microlitres du mélange préparé dans une colonne d’absorption et incubez pendant cinq minutes. Ensuite, centrifuger à 13 780 g pendant 30 à 60 secondes.
Ajouter à nouveau le filtrat obtenu dans la colonne d’absorption. Centrifugez et jetez les déchets liquides. Lavez la colonne deux fois avec 600 microlitres de solution de rinçage WB. Après la centrifugation, jetez les déchets liquides, puis placez la colonne d’absorption dans un tube de collecte vide.
Après avoir centrifugé l’échantillon à 13 780 g pendant deux minutes, laissez-le à température ambiante pour évaporer l’éthanol résiduel. Transférez la colonne d’absorption dans un tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre et ajoutez 45 microlitres d’eau désionisée stérilisée préchauffée à 65 degrés Celsius au centre de la membrane adsorbante. Cinq minutes plus tard, centrifugez le tube à 13 780 g pendant deux minutes à température ambiante.
Ensuite, utilisez un spectrophotomètre. Déterminez la concentration d’ADN dans la solution filtrée. Les rapports d’absorbance de OD260 à OD280 variaient de 1,8 à 1,84, et la quantité d’ADN dépassait 100 nanogrammes par microlitre, confirmant la bonne qualité de l’ADN extrait.
