L’objectif des tests hybrides à levures améliorées est d’identifier l’ensemble des facteurs de transcription qui se lient à une séquence d’ADN d’intérêt. L’avantage de cette technique est que la levure améliorée un-hybride analyses peuvent évaluer plus de 1000 facteurs de transcription dans une seule expérience. Inversement, l’immunoprécipitation de la chromatine n’évalue qu’un seul facteur de transcription à la fois.
Cette méthode constitue un outil clé pour la génomique fonctionnelle afin d’identifier le répertoire des facteurs de transcription qui se lient aux promoteurs et exhausteurs de gènes et d’identifier les facteurs de transcription modifiés se liant aux variantes non codantes. La démonstration de la procédure sera le Dr Xing Liu un postdoc de mon laboratoire. Décongeler les plaques de bouillon de glycérol de levure avec le tableau des proies TF sur la glace.
Resuspendez la levure à l’aide d’une pipette à 12 canaux et passez à l’étape suivante dans un délai de 1 à 3 minutes. Pour repérer la levure dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, utilisez un robot de tableau à haute densité pour sélectionner multiwell 96 plaques comme source, 96 plaques d’agar comme cible, et 96 longs tampons d’épingle. Les tablettes ne sont pas réutilisables et doivent être jetées.
Sélectionnez le programme Spot Many pour faire deux copies par plaque de puits 96. N’utilisez pas les options de recyclage ou de revisiter pour éviter la contamination arrière des stocks congelés. En outre, sélectionnez l’option de tourbillonner de haut en bas dans la source pour mélanger la levure.
Suivez les instructions pour où et quand placer les plaques et permettre au robot de repérer la levure dans sc moins les plaques rectangulaires tryptophane. Sac le tableau tacheté et l’incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 2 à 3 jours. Pour générer 384 rangées de colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 96 plaques d’agar comme source, 384 plaques d’agar comme cible et 96 tampons à broches courtes.
Sélectionnez ensuite le programme source unique de 1:4 tableau. De cette façon, quatre 96 plaques de colonie seront regroupées en une seule plaque de 384 colonies. N’utilisez pas les options de recyclage ou de revisiter pour éviter la contamination entre différentes plaques.
Sac les plaques et incuber le tacheté 384 colonie array agar côté jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 2 jours. Pour générer 1536 rangées de colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 384 plaques d’agar comme source, les plaques d’agar de 1536 comme cible et 384 tampons à broches courtes. Sélectionnez ensuite le programme source unique d’analyse 1:4.
L’objectif est de copier chaque colonie en quatre colonies pour obtenir des quadruplicates. Utilisez les options de recyclage et de revisiter car il s’agit de copier chaque colonie 4 fois. Suivez les instructions du robot et permettre au robot de repérer la levure dans les plaques avant d’ensachage et d’incubation de la colonie repérée 1536 bord de colonie côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 3 jours.
Pour amplifier le tableau de 1536 colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 1536 plaques d’agar comme source, 1536 plaques d’agar comme cible et 1536 tampons à broches courtes. Sélectionnez le programme Replicate Many pour reproduire 3 à 4 copies. Utilisez l’option recycler et revoir, mais jetez le tampon lors du passage à une plaque différente du tableau pour éviter la contamination croisée.
Permettre au robot d’amplifier le tableau de 1536 colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane. Enfin, sac les plaques et incuber le tacheté 1536 colonie array agar côté jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 3 jours à utiliser pour les étapes d’accouplement. Pour préparer les pelouses souches d’appâts d’ADN pour l’accouplement, repérer les souches d’appâts de levure d’ADN sur une plaque sc moins uracil et histidine et de croître pendant 3 jours à 30 degrés Celsius.
Stries de la levure dans un 15 centimètre Sc moins uracil et plaque d’histidine à l’aide d’un cure-dent stérile de sorte que chaque plaque s’adapte à 12 à 16 souches différentes. Incuber la plaque un jour à 30 degrés Celsius. Le lendemain, stries de la levure dans un 15 centimètre Sc moins uracil et plaque d’histidine à l’aide d’un cure-dent stérile de sorte que chaque plaque s’adapte à 4 souches différentes.
Incuber la plaque pendant une journée à 30 degrés Celsius. Après l’incubation, racler la levure à l’aide d’un cure-dent stérile, en s’assurant de ne pas gratter toute agar. Ajouter la levure dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres d’eau stérile.
Maintenant, ajoutez 10 à 15 perles de verre stériles et la suspension de levure sur une plaque rectangulaire YAPD. Agiter soigneusement dans toutes les directions pendant une minute pour s’assurer que la levure est étalée dans toute la plaque. Inversez immédiatement la plaque et appuyez sur pour que les perles aillent au couvercle.
Retirer et recycler les perles. Sac les assiettes et les incuber côté agar vers le bas pendant 1 à 2 jours à 30 degrés Celsius. Ensuite, passez à l’étape de l’accouplement.
Pour accoupler les souches d’appâts d’ADN de levure et de réseau TF, transférez le tableau TF à une plaque rectangulaire YAPD avec le robot. Sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible, ainsi que le tampon à broches courtes de 1536. Sélectionnez le programme Replicate Many.
Sélectionnez 4 plaques sources et recyclez et revisitez les options. Chaque plaque de tableau TF peut être utilisée pour transférer 3 à 4 plaques YAPD. Les plaques de tableau TF utilisées pour l’accouplement doivent avoir de 2 à 3 jours, mais pas plus car l’accouplement peut être inefficace.
Pour transférer la pelouse d’une souche d’appât d’ADN aux plaques de YAPD contenant déjà le tableau de TF, sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible et la garniture courte de 1536 goupilles courtes. Sélectionnez le programme Replicate Many. Utilisez un décalage aléatoire dans la source avec un rayon d’environ 0,6 millimètre pour éviter de prendre de la levure au même endroit et sélectionnez Mix on Target pour faciliter le contact entre les souches de levure.
Utilisez la pelouse contenant les souches d’appâts d’ADN comme source, et les plaques yapd contenant le tableau tacheté TF comme cible avant d’ensachage des plaques et de les incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant une journée. Pour la sélection de levure diploïde, sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible, et sélectionnez le tampon de 1536 broches courtes. Sélectionnez le programme Replicate.
Sélectionnez Mix sur Source et sur Target. Permettre au robot de transférer la levure accouprée des plaques YAPD à l’uracil Sc moins et les plaques de tryptophane avant d’ensachage des plaques et de les incuber côté agar vers le haut à 30 degrés Celsius pendant 2 à 3 jours. Maintenant, sélectionnez les 1536 plaques d’agar comme source et cible et le bloc-goupille court de 1536.
Sélectionnez le programme Replicate. Transférer la levure diploïde de l’uracil Sc moins et les plaques de tryptophane à la lecture rectangulaire 3-AT et X-gal contenant des plaques à l’aide du robot. Sac les assiettes et les incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pour un jusqu’à 7 jours.
Pour les souches d’appâts d’ADN avec l’activité de journaliste de fond élevé, prenez des photos les jours 2, 3 et 4. Sinon, prenez des photos aux jours 4 et 7. Gardez les plaques de tableau TF à température ambiante et copiez à nouveau après 7 jours pour une nouvelle série de dépistage.
Pour illustrer le type de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide d’analyses hybrides à levures améliorées, les régions promotrices des gènes CCL15 et IL17F ont été examinées contre un éventail de 1086 TF humains. Le promoteur du CCL15 est un exemple d’appât d’ADN non autoactif, où les interactions, même faibles, peuvent être facilement détectées. Le promoteur il17F est un exemple d’appât d’ADN autoactif avec une activité inégale de reporter de fond où certaines interactions peuvent être détectées, tandis que pour plusieurs FT, il n’est pas certain que l’activité du journaliste est plus élevée que l’arrière-plan.
Il ya plusieurs problèmes qui peuvent se produire lors de l’exécution de levure améliorée un-hybride analyses. Dans ce cas, les colonies sont trop petites et n’ont pas été transférées. En règle générale, environ 95 % des colonies de proies de la FO affichent une croissance normale.
Dans cet exemple, il n’y a pas de croissance de levure dans une partie de la plaque. Ce problème est généralement lié à une défaillance dans l’étape d’accouplement si le tampon de goupille 1536 ne parvient pas à entrer en contact avec la levure dans la pelouse de souche d’appât d’ADN, dans le tableau de TF, ou dans la plaque d’accouplement. Dans ces deux exemples, aucune interaction n’est détectée.
Ce problème est souvent lié soit à des mutations involontaires inactivant dans les gènes de reporter, en particulier LacZ, ou à une autoactivité trop élevée qui masque les interactions. Dans ce cas, la plaque présente des taches bleues aléatoires qui sont souvent liées à la contamination bactérienne. La chose la plus importante à considérer est la préparation appropriée de plaque.
S’assurer que tous les composants sont ajoutés et que la hauteur de l’agar est uniforme car toutes les étapes ultérieures en dépendent. Bien que la plupart des reagents ne soient pas dangereux, il est important de porter des gants en tout temps pour éviter la contamination des échantillons et des assiettes. Comme pour tout test de liaison de l’ADN, il est important de valider les interactions identifiées à l’aide d’analyses fonctionnelles telles que des analyses de journaliste, le knockdown de facteur de transcription ou ko, suivi de la mesure de l’expression du gène cible.
Cette méthode a permis d’identifier les facteurs de transcription qui régulent les gènes impliqués dans des processus biologiques particuliers ainsi que les facteurs de transcription avec une liaison alternative aux variantes associées à la maladie non codant.
