Pour commencer, préparez les nanoparticules d’ARN double brin de chitosane pour nourrir les larves de vers à soie. Ensuite, choisissez des larves de vers à soie du cinquième stade fraîchement muées de taille similaire pour l’expérience d’alimentation. Placez chaque larve individuellement dans un puits d’une plaque à six puits.
Couvrez l’assiette et affamez les larves pendant 24 heures. Ensuite, rincez les feuilles de mûrier fraîches avec de l’eau déminéralisée et séchez-les avec du papier absorbant propre. Coupez les feuilles entièrement séchées en disques de feuilles d’un centimètre par centimètre.
Dissoudre les nanoparticules d’ARNdb de chitosane dans de l’eau exempte de nucléases à une concentration de 500 nanogrammes par microlitre avant utilisation. Enduisez 10 microlitres de nanoparticules d’ARNdb de chitosane, de nanoparticules de chitosane de contrôle et d’ARNdb nu séparément à la surface de chaque disque de feuille de mûrier. Laissez les solutions sécher à l’air libre sur les disques de feuilles à température ambiante pendant cinq minutes.
Ensuite, offrez chaque jour un disque foliaire enrobé de nanoparticules ou d’ARNdb à chaque larve. Une fois que le disque foliaire enrobé est entièrement consommé par les larves, chaque jour, fournissez des feuilles de mûrier fraîches. Le sixième jour, placez les larves sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient immobiles.
Pour disséquer les larves, coupez le thorax avec des ciseaux sur une boîte de Pétri propre et utilisez une pince à épiler pour retirer l’intestin moyen. Après avoir retiré le contenu. laver l’intestin moyen dans une boîte de Pétri avec de l’eau sans nucléases.
Congelez l’intestin moyen à moins 70 degrés Celsius dans un tube de 1,5 millilitre. L’alimentation de nanoparticules d’ARNdb de chitosane chez les vers à soie a entraîné une réduction de 79 % des niveaux de transcrits BmToll9-2 par rapport aux traitements témoins. Les larves de vers à soie traitées avec des nanoparticules d’ARNdb de chitosane au silençage de BmToll9-2 étaient visiblement plus petites que les larves témoins.
Les cocons des larves réduites au silence de BmToll9-2 étaient également significativement plus petits que ceux du groupe témoin.
