Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. Mosquito espèces et l&#39;élevage <ol><li> Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d&#39;autres souches d&#39;intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 23,24. </li></ol> 2. ARNdb et siRNA Conception et production <ol><li> Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d&#39;intérêt. Utilisez l&#39;outil E-ARNi 25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou 19 comme décrit précédemment. <ol><li> Pour un témoin négatif, 19 synthétiser l&#39;ARN double brin correspondant à la séquence de la protéine fluorescente verte (GFP), la β-galactosidase (β-gal) ou un autre gène non exprimé chez les moustiques. Si on le souhaite, 19 l&#39;ARNdb utilisé pour générer les résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peut être utilisé comme témoin positif. Magasin ARNdb dissous dans l&#39;eau sans RNAse à -80 °; C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Alternativement, la conception siRNA spécifique du gène selon la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 10. Brouiller la séquence d&#39;un effet de choc pour concevoir siRNA siRNA contrôle négatif qui ne correspond pas à ne importe quel gène de moustique. Achetez les siRNA personnalisés, qui sont disponibles à travers un certain nombre de vendeurs de bonne réputation. <ol><li> Si on le souhaite, des siRNA 20,21 utilisée pour obtenir des résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peuvent être utilisés comme témoins positifs. Magasin siRNA dissous dans l&#39;eau sans RNase à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de chitosane / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Recueillir le sulfate de sodium 100 mM RT pré-fabriqué (100 mM de Na 2 SO 4 dans H 2 O déminéralisée) et de l&#39;acétate de sodium 0,1 M (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M d&#39;acide acétique, pH 4,5 dans désionisée H 2 O) tampons. </li><li> Dissoudre chitosane (≥75%désacétylée) dans du tampon acétate de sodium 0,1 M pour faire 0,02% (p / v) de solution de travail et maintenir la solution à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Dissoudre ARNdb ou siRNA dans 50 ul de H 2 O déminéralisée et l&#39;ajouter au tampon de sulfate de sodium 100 mM pour obtenir une solution de 100 ul de 32 ug d&#39;ARN double brin / siRNA pour 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM. </li><li> Ajouter 100 ul de solution de chitosane dans la solution ARNdb / siRNA, puis chauffer le mélange dans un bain d&#39;eau à 55 ° C pendant 1 min. Mettre en place un contrôle par addition de 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM à 100 pi de solution de chitosane et suivre la même procédure. </li><li> Mélanger les solutions immédiatement pendant 30 secondes au vortex à grande vitesse à la température ambiante pour faciliter la formation de nanoparticules. </li><li> Centrifuger le mélange à 13 000 xg pendant 10 min à température ambiante, temps au bout duquel une pastille doit être visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Air-sécher le culot pour ≈10 min à température ambiante avant de l&#39;utiliser pour préparer la nourriture de moustique. </li><li> Mesure la concentration de l&#39;ARN double brin / siRNA dans le surnageant en utilisant le surnageant de la commande (voir 3.5) comme un blanc pour calculer le montant total de l&#39;ARN double brin / siRNA qui restait dans le surnageant. Utiliser la différence entre les montants de départ de l&#39;ARN double brin / siRNA et les montants restants dans les surnageants pour calculer le pourcentage d&#39;ARNdb / siRNA piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est normalement plus de 90%. </li><li> Répétez la même procédure si plus de nanoparticules sont nécessaires. Utiliser immédiatement les nanoparticules séchées. L&#39;impact de l&#39;entreposage frigorifique des particules avant l&#39;utilisation n&#39;a pas été évaluée. </li></ol> 4. Préparation des aliments contenant du chitosane Mosquito / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Préparer 1 ml d&#39;une solution d&#39;agarose à 2% (p / v) dans de l&#39;eau déminéralisée, faire fondre l&#39;agarose, et de garder solution d&#39;agarose fondu dans un bain de 55 ° C de l&#39;eau avant utilisation. </li><li> Mélangez les flocons de nourriture pour les poissons (47% de protéines brutes, min. Matières grasses brutes 10%, max. Cellulose brute de 3%) et la levure sèche à unerapport de 2: 1 (p / p). Broyer le mélange à de petites particules avec un mortier et un pilon (passer à travers n ° 50 USA tamis standard). Utilisez la nourriture au sol, qui devrait être de couleur brunâtre, soit immédiatement, soit le stocker dans un récipient étanche à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 6 mg de nourriture au sol avec les nanoparticules séchées de la section 3.7 avec un cure-dent. </li><li> Ajouter 30 ul d&#39;une solution à 2% de pré-gel d&#39;agarose fondu au mélange alimentaire nanoparticules; remuer immédiatement et abondamment à l&#39;aide d&#39;une pointe de cure-dent ou pipette. </li><li> Utiliser le gel contenant de la nourriture et des nanoparticules pour alimenter les larves de moustiques immédiatement. En variante, une fois que le gel est complètement solidifié à la température ambiante, le gel stocker à 4 ° C et en utilisant le lendemain, ou à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 5. Nourrir larves de moustiques avec les aliments contenant du chitosane / ARN interférent nanoparticules <ol><li> Alimentation A. gambiae larves de moustiques: <ol><li> Suppression d&#39;un SIngle granulés de gel du tube de 1,5 ml en utilisant un cure-dent et le couper en six tranches égales en utilisant une lame de rasoir propre ou un cure-dent. </li><li> 20 Transfert de troisième stade larvaire dans une boîte de Petri de 500 ml contenant 100 ml d&#39;eau désionisée. </li><li> Nourrir les larves de moustiques en ajoutant une tranche de la pastille de gel (finement haché en petits morceaux) par boîte de Pétri une fois par jour pendant quatre jours. Veillez à respecter les larves se nourrissent de la pastille, qui devrait être considérablement réduite en taille ou complètement absent le lendemain. Après un temps, les moustiques se développeront en fin de quatrième stade larvaire. </li><li> Enregistrez les modifications phénotypiques visibles pendant l&#39;expérience. Examiner les niveaux de transcription et d&#39;autres changements phénotypiques comme indiqué dans l&#39;article 6 à la fin de la période de quatre jours. </li></ol></li><li> Alimentation A. aegypti larves de moustiques: <ol><li> Couper la pastille de gel en tranches égales 6 en utilisant une lame de rasoir propre ou cure-dent. </li><li> Placez 50 ans synchronisé 24 heures après l&#39;éclosion des œufs fipremier stade larvaire dans une boîte de Pétri en ≈40 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Les larves se nourrissent une tranche par boîte de Pétri pendant 4 heures / jour, puis de transférer les larves de retour à l&#39;alimentation des larves régulière de 2: 1 sol flocons de nourriture pour les poissons et la levure sèche pour le reste de la journée. Répéter l&#39;opération tous les jours pendant les quatre stades larvaires. </li><li> Examiner les niveaux de transcription et d&#39;autres changements phénotypiques comme indiqué dans l&#39;article 6 sur les points souhaités de temps de développement. </li></ol></li></ol> 6. Confirmation de Gene Knockdown <ol><li> Transcription relative quantification par qRT-PCR dans A. aegypti et A. larves gambiae. <ol><li> Effectuer et analyser des essais qRT-PCR avec trois répétitions biologiques sur au moins 10 commande groupée vs larves expérimentale comme décrit 11,19,20, ou selon la procédure de laboratoire standard. Les résultats représentatifs sont incluses ci-dessous. </li><li> Pour l&#39;analyse d&#39;une partie notamment le type de tissu / corps (ie., Le cerveau ou antenne), perform qRT-PCR comme décrit dans 6.1.1 dissection suivante pour récupérer le tissu d&#39;intérêt (par exemple, voir Mysore et al. 21). </li></ol></li><li> Confirmation de l&#39;effet de choc par hybridation in situ <ol><li> Synthétiser antisens digoxygénine marqué et le sens ribosondes de contrôle conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit 26. </li><li> Exécuter une hybridation in situ par le protocole Haugen et al. 27 pour la confirmation d&#39;effet de choc, comme décrit précédemment dans 11,20 et discuté dans la section des résultats représentatifs ci-dessous. </li></ol></li><li> Confirmation de l&#39;effet de choc par immunohistochimie <ol><li> Si des anticorps contre le produit protéique du gène ciblé sont disponibles, effectuer l&#39;immunohistochimie comme décrit précédemment 28, ce qui facilite l&#39;identification des personnes ayant les plus grands niveaux de knock-down pour l&#39;analyse du phénotype 20 comme illustré dans la representative section des résultats ci-dessous. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Le / interférer méthodologie de nanoparticules d&#39;ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentat...

moustiques vecteurs de l&#39;alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l&#39;humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d&#39;un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l&#39;infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l&#39;homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l&#39;arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour&gt; 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d&#39;environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Malgré l&#39;impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie. Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies 3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d&#39;utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité 4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l&#39;expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de 4-voler, peut promouvoir l&#39;élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d&#39;autres espèces de moustiques. Depuis sa découverte en C. elegans 7, l&#39;ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d&#39;organismes, y compris les insectes 8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l&#39;ordre par la promotion de chiffre d&#39;affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction 9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d&#39;intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l&#39;heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l&#39;entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d&#39;œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d&#39;insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l&#39;ARNi est largement utilisé pour l&#39;analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes 8,9. Trois stratégies d&#39;interférence de livraison d&#39;ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l&#39;application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l&#39;utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al 8. We ont utilisé avec succès la micro-injection 10 comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et 11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d&#39;œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l&#39;organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l&#39;organisme en interférant solution d&#39;ARN est également devenu un moyen populaire d&#39;induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d&#39;équipement ou la main-d&#39;œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d&#39;insectes étudie 8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de 15 l&#39;ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l&#39;analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. 16 décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l&#39;ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d&#39;eau contenant de l&#39;ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l&#39;immersion de l&#39;animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d&#39;imaginer comment l&#39;immersion ou la méthode d&#39;immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable. Bien que des stratégies fondées sur l&#39;ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d&#39;insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l&#39;administration orale d&#39;ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d&#39;insectes 8,17, y compris A. aegypti adultes 18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves 19 et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l&#39;expression génique dans A. aegypti larves 20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de 19 l&#39;ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d&#39;ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d&#39;ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l&#39;ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d&#39;œuvre 19, et facilite l&#39;analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l&#39;analyse des comportements 20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d&#39;inactivation de gène dans d&#39;autres insectes, y compris d&#39;autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d&#39;autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable 22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l&#39;espèce.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1429">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Reagent/Equipment</td>
			<td style="width:243px;">Company</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:663px;">Comments/Descriptions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.02 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR20</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR200</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR1000</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-046</td>
			<td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Sodium Acetate, pH 4.5</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>S0299</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td>
			<td>BDH</td>
			<td>VWR BDH3092-500MLP</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose Genetic Technology Grade</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>800668</td>
			<td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5415D</td>
			<td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chitosan, from shrimp shells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3646-25G</td>
			<td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Yeast</td>
			<td>Universal Food Corp</td>
			<td>NA</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-RNAi tool</td>
			<td>German Cancer Research Center</td>
			<td>NA</td>
			<td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goldfish food</td>
			<td>Wardley</td>
			<td>Goldfish FLAKE FOOD</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Heated water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221048</td>
			<td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-591-44</td>
			<td>for storage of ice used during the procedure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>900396</td>
			<td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microwave oven</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to prepare 2% agarose solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petridish (100X15 mm)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>875713</td>
			<td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S220</td>
			<td>for preparation of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">siRNA</td>
			<td>Thermo Scientific/Dharmacon</td>
			<td>custom</td>
			<td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)</td>
			<td>BDH/distributed by VWR</td>
			<td>VWR BDH0302-500G</td>
			<td>to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>61066-046</td>
			<td>to measure the water bath temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tooth picks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146-908</td>
			<td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ultralow freezer</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex mixer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-216-108</td>
			<td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Weight paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC9798735</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d&#39;un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d&#39;intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d&#39;un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu&#39;à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d&#39;autres espèces d&#39;insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d&#39;autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l&#39;avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d&#39;être utilisés dans le domaine.

<html> A. gambiae: Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l&#39;interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l&#39;ARN double brin. L&#39;efficacité de l&#39;incorporation dans l&#39;ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l&#39;appauvrissement de l&#39;ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force mont...

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Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l&#39;utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d&#39;ARN qui sont ingérés par les larves.

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vues.  Kansas State University.  Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves. 

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Recherche

Biologie

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

L&#39;appauvrissement de l&#39;ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...