Les études ont été financées par le Wellcome Trust et la méningite Royaume-Uni. Lignée cellulaire HBMEC a été fourni par le Dr KS Kim. Imagerie confocale et la microscopie électronique ont été effectuées dans l&#39;installation de bio-imagerie Wolfson, Université de Bristol. Nous tenons également à remercier M. Alan Leard, le Dr Mark Jepson (Université de Bristol), et M. Alan Tilley (PerkinElmer) pour leur aide et leurs conseils.

1. Immunofluorescence Protocole Semis, maladies infectieuses et l&#39;immuno-coloration Les procédures suivantes nécessitent convient de culture tissulaire de sécurité de niveau et des installations de laboratoire microbiologique. JOUR 1 A. Préparation des cellules cibles de l&#39;infection <ol><li> HBMECs des semences à 50% de confluence (~ 1.5x10 4 cellules / cm 2) sur des lamelles de verre (16 mm de diamètre) placés dans une plaque de 12 puits (3,8 cm zone de croissance 2 / puits). Milieu de croissance: RPMI 1640 complété avec inactivés par la chaleur de 15% (56 ° C, 30min) FBS, 2 mM de glutamine, 1 mM pyruvate de sodium, 100 U / ml de pénicilline / streptomycine et 1% (v / v) MEM aminés non essentiels solution de 1% des acides et des vitamines MEM solution. </li><li> Culture pendant la nuit (O / N) à 37 ° C, dans un 5% de CO 2 incubateur. </li></ol> B. culture bactérienne <ol><li> Cultiver la souche d&#39;intérêt O / N (16-18 h) sur le support de perfusion, par exemple Cœur nécessaire cervelle (BHI) gélose complétée par du sang de cheval 10% chauffé à 37 ° C en atmosphère de CO 2 5% 4. </li></ol> JOUR 2 A. Préparation de bactéries (N. meningitidis) Suspension <ol><li> En utilisant une boucle de la culture uL 10, faire une suspension de la culture bactérienne durant la nuit dans 2 mL PBSB (PBS avec du calcium et du magnésium). </li><li> Autoriser gros agrégats bactériens à régler en laissant la suspension reposer pendant 5 min à température ambiante (RT). </li><li> Sans perturber le culot, le transfert de la tranche supérieure de 1 mL de la suspension (stock d&#39;inoculum) dans un tube stérile. </li><li> Pour estimer le nombre de bactéries dans l&#39;inoculum bouillon, ajouter des aliquotes (20-50 uL) dans des tubes contenant des volumes de 1 ml de SDS 1% dans 0,1 M NaOH et mélanger délicatement pour solubiliser. </li><li> Mesurer la teneur en acide nucléique de la solution en déterminant l&#39;absorbance à 260 nm (A260). Dans nos mains, A260 de 1 correspond à 5x10 8 unités formant colonie / ml (UFC / ml). Ceci peut être vérifié en préparant une série de dilutions de l&#39;inoculum stock dans PBSB, étalement sur gélose et le comptage des colonies après O / N incubation. </li><li> Diluer une aliquote de l&#39;inoculum d&#39;actions dans le milieu d&#39;infection [(M199 supplémenté avec 2% décomplémenté (56 ° C, 30min) du sérum humain normal (SHN)] pour obtenir la densité requise bactérienne pour l&#39;infection de cellules cibles. <ol><li> Dans notre laboratoire, un ratio d&#39;infection de 200-300 bactéries par cellule cible est couramment utilisé. </li></ol></li></ol> Infection B. Culture Cellulaire <ol><li> Lavez les lamelles avec des cellules cibles en culture 3 fois avec le milieu de Hank pour enlever toute trace d&#39;antibiotiques. </li><li> Infecter les cellules fraîchement préparés suspensions bactériennes (décrit ci-dessus) pendant 3 h à 8 h à 37 ° C, en 5% de CO 2. </li><li> A la fin de la période d&#39;infection, lavez les cellules trois fois avec du PBS et de fixer dans 500 ul de 2% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 30-45 min à température ambiante ou O / N à 4 ° C. <ol><li> Fixation paraformaldéhyde à la concentration et l&#39;heure indiquées ci-dessus a été jugé approprié pour la conservation de la morphologie bactérienne et cellulaire. </li></ol></li><li> Après le lavage hors paraformaldéhyde, permeabilise les cellules paraformaldéhyde fixé par incubation dans 0,1% de Triton X-100 dilué dans du PBS pendant 10 min. </li><li> Laver les échantillons 3 fois avec PBS. </li><li> Passez à l&#39;immuno-coloration ou, alternativement, laisser des échantillons de 500 pi de 1% de BSA / PBST O / N à 4 ° C. </li></ol> JOUR 3 Immuno-marquage Coloration des bactéries intracellulaires et α-actinine peuvent être réalisées successivement ou simultanément par l&#39;utilisation d&#39;anticorps appropriés primaire et secondaire comme suit: toutes les procédures peuvent être menées en plaques de 12 puits. <ol><li> Bloquer les lamelles contenant les cellules perméabilisées avec 500 pi de 3% de BSA / PBST (PBS contenant 0,05% de Triton X-100) pendant 30-60 min à température ambiante </li><li> Après un lavage avec du PBS, le transfert de chaque lamelle d&#39;un nouveau puits à sec dans la plaque de 12 puits. </li><li> Ajouter les anticorps primaires contre les bactéries et les α-actinine, quatre-vingt à 100 uL d&#39;anticorps par la lamelle est suffisante si elle est ajoutée soin de couvrir la surface de la lamelle. Incuber pendant 1h à température ambiante. <ol><li> Nous avons utilisé antisérum polyclonal de lapin contre Neisseria meningitidis (laboratoire levés) et la souris des anticorps monoclonaux (mAb) contre α-actinine (Abcam) simultanément. Dans certaines expériences, à la place de l&#39;anti α-actinine, anticorps monoclonaux contre l&#39;actine ou la vimentine ont été utilisés (Sigma). </li></ol></li><li> A la fin de l&#39;incubation, ajouter 200 ul de PBS pour le bien, soulever la lamelle et la placer dans un nouveau puits contenant 500 ul de PBS. </li><li> Après 5 min, retirez du PBS par pipetage, puis ajouter du PBS frais. Répéter deux fois. Transfert à un couvre-nouveau puits à sec. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire approprié conjugué à des fluorochromes différents dilué dans 1% de BSA / PBST; incuber à température ambiante pendant 1h dans le noir. <ol><li> Pour la détection de bactéries, nous avons utilisé anti-lapin conjugué à la TRITC Ig et pour la détection de la protéine α-actinine et les autres du cytosquelette, nous avons utilisé Ig anti-souris conjugué à la FITC soit (Sigma) ou Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> A la fin de l&#39;incubation, laver comme dans les étapes 4 et 5. </li><li> Contre tache avec 0,6 mg / ml en PBS DAPI (colorant ADN) pendant 5 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer avec du PBS. </li><li> Mont lamelles (cellules vers le bas) sur des lames avec une goutte de milieu de montage (e, g. Mowiol ou Vectashield) </li><li> Conserver dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Les échantillons sont prêts pour l&#39;observation au microscope. </li></ol> 2. Microscopie confocale à balayage laser (CLSM) Pour observer et capturer des images de bactéries intracellulaires et des éléments du cytosquelette, nous avons utilisé des échantillons immunomarquées et les images capturées en utilisant un Leica SP5-AOBS microscope confocal à balayage laser attaché à un Leica DM i6000 microscope à épifluorescence inversé. Toutes les images ont été recueillies en utilisant un 63x NA 1,4 objectif à immersion d&#39;huile et le processus avec le logiciel Leica. Procédure de CLSM: <ol><li> Pour commencer la procédure CLSM, ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion à l&#39;objectif et placer la lame spécimen, lamelle vers le bas, sur la platine du microscope. </li><li> Régler le microscope à un mode visuel et de trouver la zone d&#39;intérêt en utilisant les oculaires du microscope. </li><li> Utilisation du logiciel Leica, sélectionnez le mode d&#39;acquisition xyz. </li><li> Sélectionnez le format de 512 x 512 (taille d&#39;image). Pour les études colocalisation, la plus haute résolution, la plus précise de l&#39;image; en gardant à l&#39;esprit la limite de résolution du microscope. Ensuite, sélectionnez le mode bidirectionnel X, ce qui augmentera la vitesse de balayage et d&#39;aider à réduire la photo-blanchiment. </li><li> Mettre en place séquentielle des paramètres de numérisation. Cliquez dans le &quot;seq&quot; fonction et choisir l&#39;un des modes de numérisation. Nous utilisons des «entre les lignes&quot; mode. </li><li> Sélectionnez laser poutres selon les fluorochromes conjugués aux anticorps secondaire: 405 nm pour le DAPI (bleu), 488 nm pour Alexa Fluor 488 (vert) et 561 nm pour TRITC (rouge). Activer tube photomultiplicateur (PMT) 1, 2 et 3, respectivement. Réglez les paramètres de PMT pour détecter la longueur d&#39;onde d&#39;émission correcte. </li><li> Mettre en place des haut («commencer») et en bas («fin») de Z-piles ou une série. Ensuite, réglez le nécessaire &quot;z-pas de taille&quot;. <ol><li> Neisseria meningitidis est un diplocoque (figure 1G) et puisque chaque coccus a un diamètre approximatif de 0,5 um, la taille z-étape de 0,20 um a été choisi pour renforcer la probabilité de scanner chaque coccus au moins deux fois. Il est également à la taille du pas pour une résolution optimale de 0,1 - 0,2 um. </li></ol></li><li> Définissez les paramètres de numérisation finale en choisissant une moyenne de 3 lignes pour améliorer le rapport signal sur bruit. </li><li> En cliquant sur &quot;démarrer&quot; images doubles ou triples colorées sont obtenues par balayage séquentiel différentes longueurs d&#39;onde pour éliminer la diaphonie entre différents chromophores. </li><li> Pour une indication de la co-localisation des deux fluorochromes, sélectionnez l&#39;option &quot;overlay&quot; fonction pour fusionner les canaux sélectionnés en une seule image, par exemple, lorsque les deux Alexa 488 (vert) et TRITC (rouge) fluorochromes colocalise, la couleur jaune apparaît dans l&#39;image superposée . </li><li> Compiler z-piles ou une série en utilisant la &quot;projection maximale&quot; de fonction pour la construction d&#39;une image 2D requis pour visualiser colocalisation possible. Une analyse plus détaillée de la co-localisation peut être obtenue par l&#39;analyse de chaque section optique. </li><li> Après l&#39;acquisition de la Z-piles ou une série, traiter vos données pour obtenir une image orthogonale pour la visualisation de la localisation intracellulaire des différents éléments (figure 1E). </li></ol> 3. Quantification de colocalisation Les analyses statistiques des images microscope confocal à balayage sont réalisées avec le logiciel Volocity (Improvisation, PerkinElmer). Ce logiciel offre un outil conçu spécifiquement pour l&#39;analyse de co-localisation tels que décrits par Manders et al. (1993) 5. Colocalisation dans le contexte de l&#39;imagerie de fluorescence numérique peut être décrite comme la détection d&#39;un signal à la même voxel (volume pixel) l&#39;emplacement de chaque canal. Les deux canaux sont constitués d&#39;images de deux fluorochromes différents pris dans la zone même échantillon (guide de l&#39;utilisateur Volocity). Les analyses statistiques sont réalisées avec le logiciel Volocity (Improvisation, PerkinElmer) en utilisant l&#39;analyse quantitative colocalisation décrit ci-dessous. Analyse quantitative colocalisation <ol><li> Créer une bibliothèque avec des images en utilisant le logiciel Volocity CLSM. </li><li> Sélectionnez &quot;focus étendue&quot; de l&#39;image dans la barre supérieure. Cet outil va compiler z-piles dans une image 2D à analyser. </li><li> Sélectionnez «colocalisation» de l&#39;outil. Les deux canaux à analyser doit avoir la profondeur de la même couleur. </li><li> Sélectionnez la zone que ça va être quantifiés. Régler le seuil de supprimer tout fond. </li><li> Créer la sortie colocalisation en sélectionnant «générer colocalisation». Statistiques colocalisation sont générés pour les régions d&#39;intérêt sélectionnées précédemment. </li><li> Sélectionnez Manders coefficients R (coefficient de recouvrement) et Ma (coefficient de co-localisation). <ol><li> Coefficients Manders ne sont pas sensibles à l&#39;intensité de la coloration comme ils sont normalisés par rapport à l&#39;intensité des pixels au total, de sorte qu&#39;ils peuvent être employés lorsque la coloration d&#39;un antigène est plus forte que l&#39;autre. </li><li> Overlap R coefficient en fonction de Manders 5,6 représente le degré réel de colocalisation, c&#39;est à dire le nombre de pixels qui colocalise par rapport au nombre total de pixels. </li><li> D&#39;autre part, le coefficient de co-localisation, Mon, décrit la contribution de fluorescence de la fraction plus abondante (dans ce cas α-actinine, vert) à la moitié moins abondantes (dans ce cas, les bactéries, rouge), c&#39;est à dire le nombre de pixels rouges qui se chevauchent avec des pixels verts par rapport au nombre total de pixels rouges. </li><li> Coefficients Manders comprise entre 1 et 0, 1 étant co-localisation haute, 0 aucun être, mais ils peuvent être exprimés en pourcentage pour faciliter l&#39;interprétation. </li></ol></li><li> Les statistiques d&#39;exportation des valeurs d&#39;un document Excel pour la présentation des données. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Localisation intracellulaire des OPC exprimer Neisseria meningitidis et les α-actinine Imagerie confocale du cerveau humain cellules endothéliales microvasculaires infectés par Nm pour 3 et 8 heures comme décrit ci-dessus indiquée de colocalisation α-actinine et Nm, ce qui semblait être moins fréquents dans les trois expériences d&#39;infection h (non montré) par rapport aux cultures infectées pendant 8 h ( Figure 1 AF). Une colocalisation démontrable de α-actinine avec OPC-exprimant méningocoques a été observée à chaque fois dans&gt; 5 expériences répétées. L&#39;analyse statistique des co-localisation à partir de plusieurs images confocale a été réalisée comme décrit ci-dessus. Globalement, dans HBMEC infectés avec OPC-exprimant les méningocoques,&gt; 25% de chevauchement de la verdure (α-actinine) et rouge (Nm) pixels a été obtenue (figure 2B, Overlap coefficient R). Contrairement aux α-actinine, des expériences dans lesquelles l&#39;étiquetage des bactéries internalisées et soit l&#39;actine ou la vimentine a été réalisé, co-localisation occasionnelle a été observée avec l&#39;actine mais avec la vimentine était rare (Figure. 2B). Les données ont également été analysés en utilisant le coefficient, Ma, qui prend en compte l&#39;abondance relative de chaque fraction. Ma est une mesure de la fréquence d&#39;apparition du signal plus abondante (dans ce cas, verte, α-actinine) chaque fois que le signal le moins abondant (dans ce cas, rouges, bactéries) se produit. Cette mesure montre un niveau frappant de survenance d&#39;α-actinine dans les environs de intériorisé méningocoques (figure 2A et C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Microscopie confocale à balayage laser pour évaluer les interactions intracellulaires de N. meningitidis avec les α-actinine. AH. Confluent des monocouches endothéliales cultivées sur lamelles ont été infectés avec l&#39;OPC-exprimant (AF) N. meningitidis. Après 8 h, non-adhérent bactéries ont été lavés, des cellules fixées avec du paraformaldéhyde et perméabilisées avec 0,1% de Triton X-100. Par la suite, les bactéries et les α-actinine ont été colorées comme décrit ci-dessus (α-actinine, vert, bactéries, rouge). AC. Un champ de montrer des images xy de l&#39;emplacement de Nm (A) ou α-actinine (B). La superposition d&#39;image dans (C) indique plusieurs régions dans lesquelles couleur jaune-orange apparaît suggérant colocalisation. Les flèches en (A) et (B) montrent les régions où un haut degré de α-actinine l&#39;accumulation semble avoir eu lieu autour des bactéries. D. Dissection optique d&#39;une co-localisation HBMEC monocouche infectée indiquant autour des bactéries intracellulaires situé à la base d&#39;une cellule. Encore une fois, cette co-localisation n&#39;est pas due à la proximité accidentelle d&#39;α-actinine, comme le général tache de α-actinine dans cette région est faible. E et F. images tridimensionnelles des monocouches infectées HBMEC traitées comme ci-dessus. Une vue oblique de la surface apicale (E) montre bactéries adhérentes colorés en rouge (flèche rouge), alors que plusieurs bactéries situées vers les surfaces basales des cellules endothéliales (flèche jaune) sont nettement orange / jaune. Lieu basale peut être plus clairement vu dans (F) qui est une fin en XZ section. G. Une image d&#39;électron négatif teinté microscope de N. meningitidis montrant sondiplococcal prédominante à partir. Chaque coccus est d&#39;environ 0,5 m de diamètre. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Localisation et distribution des α-actinine, l&#39;actine et la vimentine dans les cellules HBMEC. Monocouches A. infectée de HBMEC ont été traités comme décrit dans la légende ci-dessus mais en plus de α-actinine, quelques lamelles ont été utilisés pour la détection de l&#39;actine ou la vimentine par procédure similaire à celle de α-actinine. Comme ci-dessus, α-actinine concentrées autour de plusieurs bactéries intériorisées (flèches blanches). Vimentine et l&#39;actine n&#39;a pas colocalise avec des bactéries à un niveau appréciable. Barre représente 20 um. B. &amp; C. Les valeurs des coefficients R et My ont été obtenus à partir de plus de trois expériences en utilisant le logiciel Volocity comme décrit précédemment.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

La possibilité de lier des intériorisé Opc exprimant Neisseria meningitidis aux α-actinine a été explorée à l&#39;aide HBMEC par l&#39;examen de la co-localisation de bactéries et de la protéine du cytosquelette dans les cellules infectées après 3 et 8 h d&#39;incubation. Par microscopie confocale, co-localisation de Neisseria meningitidis avec α-actinine a pu être démontrée. Notamment, bien que les bactéries ont été intériorisées à 3 h, il y avait co-localisation peu avec α-actinine à ce point dans le temps. Association bactérienne avec la protéine du cytosquelette semblait exiger une plus longue période de résidence intracellulaire après 8 h période d&#39;infection, un nombre important de bactéries avaient α-actinine, apparemment en étroite association. Alpha-actinine est une protéine multifonctionnelle, et les interactions des bactéries avec l&#39;élément du cytosquelette pourraient avoir une influence significative sur la fonction des cellules cibles, qui est un sujet d&#39;études en cours. La quantification des co-localisation comme décrit ci-dessus nécessite la préparation des échantillons méticuleux. Une attention particulière devrait être accordée à la fixation des échantillons, le blocage des dilutions époque et d&#39;anticorps. Pour le meilleur rapport signal sur bruit, chaque anticorps primaire et secondaire doit être augmentée par des expériences préliminaires pour déterminer les concentrations optimales. Dans notre expérience, le milieu de montage Mowiol produit de meilleures images.

1. Microscopie confocale à balayage laser (CLSM): Leica SP5 imagerie confocale système: Ce système, en utilisant une combinaison de AOTF (acousto-optique filtre accordable) et une AOBS (acousto-optique séparatrice), simplifie l&#39;excitation avec des longueurs d&#39;onde spécifiques. 2-logiciel: Leica confocale logiciels LCS, Leica Microsystems, en Allemagne. Volocity 5, Improvisation, PerkinElmer, USA.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

La protéine Opc de Neisseria meningitidis (Nm, méningocoque) est une protéine exprimée en surface intégrante membrane externe, qui peut agir comme une adhésine et un invasine efficace pour les cellules humaines épithéliales et endothéliales. Nous avons identifié endothéliales surface située en tant que récepteurs intégrines majeur pour l&#39;OPC, un processus qui exige Opc pour lier des ligands de l&#39;intégrine premier telles que la vitronectine et via ces à la cellule-récepteurs exprimés 1. Ce processus conduit à l&#39;invasion bactérienne des cellules endothéliales 2. Plus récemment, nous avons observé une interaction des OPC avec une protéine 100kDa trouve dans lysats de cellules entières de cellules humaines 3. Nous avons d&#39;abord observé cette interaction lorsque les protéines de la cellule hôte séparées par électrophorèse et transférées sur nitrocellulose ont été superposées avec OPC-exprimant Nm. L&#39;interaction est directe et ne comportait pas de molécules intermédiaires. Par spectrométrie de masse, nous avons établi l&#39;identité de la protéine comme α-actinine. Comme aucune surface exprimée α-actinine a été trouvé sur une des lignes de huit cellules examinées, et que les interactions avec les cellules endothéliales Opc dans la présence de plomb sérique à l&#39;entrée des bactéries dans les cellules cibles, nous avons examiné la possibilité de deux protéines interagissant intracellulaire. Pour cela, le cerveau humain en culture des cellules endothéliales microvasculaires (HBMECs) étaient infectés par Opc exprimant Nm pour des périodes prolongées et les emplacements des bactéries internalisées et α-actinine ont été examinés par microscopie confocale. Nous avons observé en fonction du temps augmentation de co-localisation des Nm avec la protéine du cytosquelette, qui était considérable, après une période de huit heures d&#39;internalisation bactérienne. En outre, l&#39;utilisation de logiciels d&#39;imagerie quantitative nous a permis d&#39;obtenir une mesure relative de la co-localisation des Nm avec α-actinine et les autres protéines du cytosquelette. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation et la quantification de la co-localisation de la bactérie à des protéines intracellulaires après l&#39;entrée des bactéries dans des cellules endothéliales humaines, bien que la procédure est également applicable aux cellules épithéliales humaines.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), un agent pathogène respiratoire gram négatif humaines spécifiques, peuvent se lier aux humains α-actinine. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation de co-localisation de la bactérie intracellulaire avec des α-actinine après l&#39;entrée des bactéries dans les cellules humaines endothéliales microvasculaires du cerveau (HBMECs).

Visualisation et quantification des interactions intracellulaires des Neisseria meningitidis Et l&#39;homme α-actinine par imagerie confocale

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K vues.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), un agent pathogène respiratoire gram négatif humaines spécifiques, peuvent se lier aux humains α-actinine. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation de co-localisation de la bactérie intracellulaire avec des α-actinine après l'entrée des bactéries dans les cellules humaines endothéliales microvasculaires du cerveau (HBMECs).

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Recherche

Immunologie et infection

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Sondes de projection optique de nouvelles bactéries spécifiques sur les tissus pulmonaires humains Ex Vivo par endomicroscopie confocale par Laser

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...