Nous tenons à remercier Ying Yu pour Apc Min / + souris génotypage. Cette étude a été soutenue par des fonds de l&#39;INSERM et de subventions (CA057621 et AI053194) des National Institutes of Health.

NOTE: Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC), UCSF. Toutes les expériences d&#39;imagerie sont des procédures non-survie et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l&#39;acquisition de l&#39;image. 1. génération de souris REMARQUE: Apc Min / + souris, porteuses d&#39;une mutation sur le gène Apc, développent spontanément 50-100 adénomes dans l&#39;intestin grêle. <ol><li> Cross Apc Min / + souris avec la ligne ACTB-ECFP, qui exprime ECFP sous le promoteur de l&#39;actine, et en outre avec la ligne c-fms-EGFP, qui exprime EGFP sous le promoteur c-fms pour détecter les cellules myéloïdes. Animaux hétérozygotes pour ACTB-ECFP et c-fms-EGFP sont utilisés pour détecter la fluorescence. </li><li> Utilisez la souris à 3-4 mois d&#39;âge à l&#39;image adénomes clairement détectables. </li></ol> 2 Préparation de Matières avant la chirurgie REMARQUE: Les détails du microscope set-up ont été décrites précédemment 6,7. <ol><li> Microscope <ol><li> Allumez la couverture chauffante. Allumez le laser à l&#39;argon pour excitation à 488 nm et à l&#39;état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers. Allumer le microscope, l&#39;unité de commande de disque en rotation, l&#39;AOTF, l&#39;unité de commande de laser, et l&#39;unité de commande de caméra. </li><li> Ouvrez le volet de microscope, qui transforme la LED rouge. Mettez le logiciel de l&#39;ordinateur et l&#39;appareil photo. </li></ol></li><li> Plate-forme d&#39;imagerie <ol><li> Assurez-vous que la pièce de théâtre est propre. Sinon, nettoyer à l&#39;eau et au savon puis séchez. </li><li> Prenez deux lamelles et utiliser du ruban de laboratoire pour les fixer sur l&#39;insert. Placer l&#39;insert sur la scène et le nettoyer avec des lingettes alcoolisées. </li><li> Avec du ruban de laboratoire, fixez la couverture chauffante sur le côté droit de la scène. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de la membrane de caoutchouc sur le cône de nez et la changer si nécessay. Positionner et fixer le cône de nez pour la livraison de l&#39;isoflurane à l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;une gaze et bande de laboratoire. </li></ol></li><li> L&#39;isoflurane système anesthésie <ol><li> Remplir le réservoir de l&#39;isoflurane. </li><li> Allumez le vide et ajuster à 1,2 L / min. </li><li> Ajouter de l&#39;eau distillée pour le nébuliseur et connecter le nébuliseur au système isoflurane. </li><li> Mettez l&#39;analyseur d&#39;oxygène et le connecter au système de l&#39;isoflurane. Mettez le réservoir d&#39;oxygène et de s&#39;assurer que l&#39;analyseur d&#39;oxygène montre 100%. Réglez le débit O 2 à 0,2 L / min. </li><li> Mettez le réservoir d&#39;azote et régler le débit à 0,8 L / min. Assurez-vous que l&#39;analyseur d&#39;oxygène montre 21%. </li></ol></li><li> Préparation des outils de chirurgie et la plate-forme <ol><li> Nettoyer les 2 paires de pinces à dissection et ciseaux avec de l&#39;eau et du savon. </li><li> Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Stériliser les outils de chirurgie pendant 30 sec. Laissez-les refroidir. </li><li> Placez un maturateur de laboratoire sur le banc de la chirurgie. </li><li> Utilisez un couvercle en polystyrène comme une plate-forme chirurgicale. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant. Préparer un deuxième morceau de laboratoire suintant changer après le rasage de la souris. </li><li> Placez le cône de nez à la ligne de l&#39;anesthésie sur le couvercle en polystyrène recouvert, et fixez-le sur le couvercle en polystyrène (pas sur le maturateur de laboratoire) avec un peu de ruban et utiliser deux aiguilles des deux côtés du cône de nez à la maintenir en place. </li><li> Assemblez la bétadine, des tampons d&#39;alcool, gaze stérile, super colle, lames de microscope, rasoir électrique, et 4 morceaux de ruban de laboratoire. </li></ol></li></ol> 3 Préparation des injections <ol><li> Sous le capot, préparer une seringue à insuline (28 G x ½ po) avec 7 pi de Ly-6G (Gr1) anticorps actions AF647 conjugué (1 mg / ml) dans 100 ul de 2000 kDa rhodamine-dextran (4 mg / ml ) pour l&#39;injection de rétro-orbital. Injection rétro-orbitaire est recommandé Min / + souris Apc depuis l&#39;anémie qui se développe dans ces animaux fait la queue veines difficult pour détecter à travers la peau. </li><li> Préparer une seconde seringue d&#39;insuline de 1 mg / kg d&#39;atropine dilué dans 150 ul de PBS par voie sous-cutanée (sc), injection avant l&#39;imagerie pour amortir les mouvements péristaltiques de l&#39;intestin. </li></ol> 4 Préparation de l&#39;intestin pour l&#39;imagerie <ol><li> Vérifiez que la ligne de l&#39;anesthésie à la chambre d&#39;admission est ouverte, et les lignes de la table d&#39;opération et microscope sont fermés. </li><li> Transfert de l&#39;animal à la chambre d&#39;anesthésie. Fermer la chambre d&#39;anesthésie et tourner sur la isoflurane à 4% (avec 21% d&#39;O 2). </li><li> Lorsque la souris respire profondément et lentement (après 5-6 min), la transférer à l&#39;étape chirurgicale sur son flanc et injecter la solution d&#39;anticorps Gr1 et / ou une solution de dextrane rétro-orbitale. </li><li> Ouvrez la ligne de l&#39;anesthésie liée à la plate-forme chirurgicale. Fermer la ligne de la chambre d&#39;anesthésie et de mettre la souris sur le dos avec son nez dans le cône de l&#39;anesthésie. </li><li> Réduire le isofluraneconcentration de 4% à 2,5%. </li><li> Vérifiez que la souris est bien anesthésié en pinçant sa patte et tester le réflexe cornéen. </li><li> Ajouter ophtalmique lubrifiante pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. </li><li> Fixez les membres de la souris à l&#39;étape chirurgicale en ajoutant bande de laboratoire. </li><li> Enlever les poils de la surface ventrale en utilisant un rasoir électrique. Également supprimer les cheveux de la patte arrière gauche pour positionner l&#39;oxymètre avant l&#39;acquisition. Retirer le maturateur de laboratoire de l&#39;étape chirurgicale et le remplacer par un propre pour éviter la contamination de cheveux. </li><li> Désinfecter la surface ventrale avec des lingettes d&#39;alcool et de la bétadine. </li><li> Injecter la solution d&#39;atropine (de 3,2) ms dans un flanc de la souris. </li><li> Faire une incision ventrale de 1 cm de la ligne médiane à travers la peau et le péritoine à l&#39;aide de ciseaux et une paire de forceps. Retirez doucement 3-4 cm de l&#39;intestin et d&#39;identifier un ou plusieurs tumeurs à l&#39;image. </li><li> Prenez un micr de verretoboggan oscope et la position d&#39;une boucle de l&#39;intestin sur elle avec une tumeur dans la partie supérieure. </li><li> Ajoutez un peu de super glue à quelques endroits le long de l&#39;intestin pour le fixer à la diapositive. Attendez une minute pour que la colle sèche. Utilisez un marqueur pour dessiner une ligne sur la diapositive montrant la tumeur afin de faciliter sa localisation avec le confocale. </li></ol> 5. positionnant la souris sur la scène et préparation pour l&#39;acquisition de l&#39;image <ol><li> Retirer le ruban de laboratoire de membres. </li><li> Ouvrez la ligne de l&#39;anesthésie à la platine du microscope et de fermer celui de la plate-forme chirurgicale. </li><li> Transférer la souris avec soin à la platine du microscope avec son côté ventral vers le bas et son nez dans le cône de nez. Fixer la ligne d&#39;anesthésie avec du ruban laboratoire. </li><li> Re-positionner la souris et / ou le chariot afin d&#39;avoir l&#39;intestin dans le centre de l&#39;une des fenêtres de couverture-glissé. Collez doucement la lame avec du ruban de laboratoire. </li><li> Fixer la sonde d&#39;oxymètre à la branche gauche de la souris poursuivre son taux et la saturation artérielle en oxygène niveaux respiratoires et cardiaques. </li><li> Couvrir la souris avec la couverture chauffante pour éviter l&#39;hypothermie. </li><li> Réduire la concentration d&#39;isoflurane de 2,5% à 1-1,5% pour l&#39;imagerie. </li></ol> 6 Acquisition d&#39;images à l&#39;aide du logiciel μManager <ol><li> Augmenter la vitesse de CSUX à 2500 rpm pour améliorer la qualité d&#39;image dans les paramètres de configuration. </li><li> Utilisez le menu déroulant pour choisir Objectif 10X 0,5 NA NA ou 20X 0,75 Fluar objectif de l&#39;objectif. </li><li> Choisissez le laser 405 nm de couleur menu déroulant. </li><li> Cliquez sur le Live et la mise au point avec le microscope. </li><li> Cliquer sur automatique pour ajuster automatiquement les intensités maximale et minimale de pixel de l&#39;image d&#39;affichage sur la base des valeurs des pixels extrêmes de l&#39;image. Un histogramme des intensités des pixels de l&#39;image d&#39;affichage est présenté dans le graphique de la partie inférieure de la fenêtre principale. </li><li> Réglez l&#39;exposition de l&#39;appareil photo dans la fenêtre Panneau de configuration Piper parla modification du nombre d&#39;impulsions d&#39;horloge (horloge est une 33,333 ms). </li><li> Si le signal est trop lumineuse à l&#39;exposition la plus faible, diminuer l&#39;intensité du laser à l&#39;aide de l&#39;unité de commande du microscope. </li><li> Vérifiez l&#39;intensité du signal pour 488 nm, 561 nm et 640 nm lignes laser. Ajuster l&#39;intensité du laser avec sa propre unité de contrôle du laser (488 nm et 561 nm) ou de l&#39;unité de commande du microscope. </li><li> Dans la fenêtre multi D Acquisition, cochez la case points de temps et entrez dans nombre de points dans le temps et l&#39;intervalle de temps souhaité. </li><li> Cochez la case Z-piles, choisissez &quot;Z relative» et de définir Z-start et Z-end par rapport à la position actuelle. REMARQUE: Pour 10X ou 20X objectif, commencez par 3 avions de Z, 8 pm ou 4 um part respectivement. </li><li> Cochez la case multiples positions (XY) pour l&#39;imagerie de plusieurs endroits, puis cliquez sur Modifier la liste de position, marquer 4 à 6 positions différentes. </li><li> Cochez la case Canaux et ajouter des canaux de Nouveau et sélectionnez lasers lignes dans le menu déroulant et type de l&#39;exposition pour chaque canal (par multiples de 33,333 ms). </li><li> Sélectionnez l&#39;option Enregistrer les images dans la fenêtre &quot;d&#39;acquisition multi D&quot;. </li><li> Sélectionnez un dossier et toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier avec le préfixe donné. REMARQUE: Chaque acquisition continue sera enregistré dans un sous-dossier séparé sous forme de fichiers TIFF individuels pour chaque tranche de Z dans chaque couleur à chaque point de temps. </li><li> Enregistrer tous les paramètres en cliquant sur Enregistrer les paramètres dans la fenêtre multi D acquisition. </li><li> Cliquez sur Acquérir dans la fenêtre Acquisition multi-dimensionnelle pour lancer l&#39;acquisition. </li><li> Si la sonde de l&#39;oxymètre n&#39;est pas utilisé ou bien cesse de travailler (quand le pouls n&#39;est pas stable ou difficiles à détecter), vérifier l&#39;efficacité de l&#39;anesthésie toutes les 15 minutes au cours de la procédure d&#39;imagerie en pinçant la patte et de vérifier le réflexe cornéen. Réglez l&#39;anesthésie si la souris est sensible à ces stimuli. </li><li> Après l&#39;acquisition, euthanasier la souris en augmentant la concent isofluraneration à 5%. En l&#39;absence de mouvements respiratoires sont détectables, retirez la souris de la scène et effectuer une dislocation cervicale. </li></ol> 7 Analyse des images à l&#39;aide du logiciel Imaris <ol><li> Conversion de fichiers .ims (complémentaire figure 1A) <ol><li> Ouvrez le logiciel de la caméra, cliquez sur Fichier, puis sur Batch Converter. </li><li> Cliquez sur Ajouter des fichiers et sélectionnez le premier fichier de la première position. Répétez l&#39;opération pour chaque position. </li><li> Pour chaque fichier téléchargé, cliquez sur Paramètres, puis vérifiez que les paramètres &quot;t&quot; pour l&#39;heure, &quot;c&quot; pour les canaux et &quot;z&quot; pour Z-piles apparaissent dans cet ordre. </li><li> Enregistrer dans le dossier souhaité. Parcourir et créer un nouveau fichier converti. </li><li> Cliquez sur Set pour tous et Lancer. </li></ol></li><li> Ajustements (complémentaire figure 1B) <ol><li> Allez dans le dossier Converted spécifique et ouvrez le premier fichier. </li><li> Dans la fenêtre de réglage de l&#39;affichage, régler le fondcoupure de signal en modifiant le nombre minimal pour chaque canal si nécessaire. </li><li> Si nécessaire, ajuster l&#39;intensité du signal en modifiant le nombre Max (plus le nombre de Max, plus l&#39;intensité du signal). REMARQUE: Les ajustements de l&#39;intensité du signal / contraste permettent le point culminant d&#39;un comportement de la cellule ou un compartiment afin d&#39;avoir une visualisation plus agréable. Il ne change pas le résultat lui-même. </li><li> Cliquez sur Modifier et Propriétés de l&#39;image. </li><li> Modifiez les x, y et z des valeurs (pour un objectif 10x, x et y = 0,712, z = 8 pm; d&#39;un objectif 20X: x et y = 0,36, z = 4 pm). </li><li> Cliquez sur Tous équidistante à ajuster les points de temps. Ajouter la date de début et l&#39;heure de début de l&#39;acquisition. Ajouter la date de fin et l&#39;heure de fin de l&#39;acquisition (complémentaire figure 1C). </li><li> Cliquez sur le bouton Play pour regarder le film. </li><li> Cliquez sur Modifier et supprimer des points de temps pour supprimer les images floues. </li><li> Pour joindre deux acquisitions séparées together dans un film, aller au dernier point du premier film de temps et cliquez sur Modifier&gt; Ajouter des points de temps pour ajouter le second fichier. </li></ol></li><li> Enregistrement comme un film (complémentaire figure 1D) <ol><li> Cliquez sur Enregistrer, choisissez l&#39;extension mov et un facteur de compression de 0. </li><li> Cliquez sur Enregistrer. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dans cet article, un protocole détaillé est décrit pour la filature disque imagerie confocale de la dynamique des cellules myéloïdes in tumeurs intestinales pendant plusieurs heures dans un animal vivant, imagé du côté de la séreuse de l&#39;intestin. Pour éviter l&#39;inflammation et d&#39;avoir des conditions physiologiques optimales, l&#39;imagerie de l&#39;intestin qui doit être fait sur l&#39;organe intact. Cependant, l&#39;imagerie de la face séreuse de l&#39;intestin est d...

Des preuves irréfutables démontrent maintenant que le microenvironnement de la tumeur, constitué de populations cellulaires hétérogènes, y compris les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et inflammatoires, la matrice extracellulaire et les facteurs solubles, joue un rôle crucial dans l&#39;initiation et la progression des tumeurs solides, en contribuant à la quasi-totalité caractéristiques du cancer 1. En effet, au cours de la progression de la tumeur, il existe des interactions dynamiques constants entre les cellules cancéreuses et les cellules transformées stromales qui évoluent à générer un micro-environnement favorable à la malignité 2. Parmi les cellules immunitaires infiltrant la micro-environnement de la tumeur, les cellules myéloïdes sont les plus abondants 3. Composé de macrophages associés aux tumeurs (TAM), les cellules suppressives myéloïdes dérivées (MDSC), les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles (PMN), les cellules myéloïdes sont recrutés dans la moelle osseuse et infiltrent progressivement les tumeurs, en libérant des cytokines, des facteurs de croissance et des protéases qui peut favoriserla croissance de la tumeur et la propagation 4. La diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules myéloïdes est complexe mais dynamique. Ainsi, la compréhension de la nature de leurs interactions est cruciale pour déterminer pourquoi ces cellules favorisent la progression du cancer au lieu de participer à une réponse immunitaire anti-tumorale, et peut aider à trouver de nouvelles cibles pour le contrôler. L&#39;observation directe par microscopie intravitale fournit des informations sur la dynamique des cellules dans les tissus de souris vivantes 5. A quatre couleurs, multi-région, micro-lensed filature disque système confocal a été conçu pour étudier les cellules stromales dans les tumeurs mammaires 6. Cette approche permet une imagerie continue à long terme et comprend plusieurs avantages tels que (a) l&#39;acquisition des images rapides afin de minimiser les artéfacts de mouvement, (b) l&#39;anesthésie à long terme, (c) quatre d&#39;acquisition de couleur pour suivre différents types de cellules, (d) marquage fluorescent des différentes composantes tumorales, et (e) l&#39;observation de différents micro-environnements tumoraux esprithin la même souris pour éviter la souris à la variabilité de la souris 7-9. Avec cette technologie, les comportements cellulaires différentes ont été rapportées dans le virus de la tumeur mammaire de modèle (MMTV) polyome milieu de promoteur-oncogène T entraînée (PyMT) qui affiche les étapes progressives de la tumorigenèse. Lymphocytes T régulateurs (Treg, visualisées par le transgène Foxp3 EGFP) migrer préférentiellement à proximité des vaisseaux sanguins que DCs (CD11c-DTR-EGFP), des fibroblastes de carcinome associé (FSP1 + / + -EGFP) et des cellules myéloïdes (c-fms -EGFP) présentent une motilité supérieure à la périphérie de la tumeur à l&#39;intérieur de la masse tumorale. Dans la condition d&#39;hypoxie systémique aiguë, les cellules ont migré différemment: Tregs arrêter la migration contrairement aux cellules myéloïdes qui continuent à se déplacer 6. En outre, dans le même modèle de la souris, il a été montré que la sensibilité de la doxorubicine change avec le stade tumoral, la distribution du médicament est lié à la réponse aux médicaments, et de la doxorubicinetraitement conduit au recrutement de CCR2-dépendant des cellules myéloïdes à des tumeurs. Ainsi, l&#39;imagerie en direct peut également être utilisé pour mieux comprendre la réponse aux médicaments in situ et la biologie de la chimiorésistance 10,11. Polypose adénomateuse familiale (Apc) des mutations génétiques se produisent généralement dans les adénomes colorectaux humains et les carcinomes 12 et mutation d&#39;une seule copie des résultats de gène APC dans la polypose adénomateuse familiale (FAP), qui confère un risque extrêmement élevé de cancer du côlon 13. La souche de souris Apc Min / + porte une mutation de troncature au niveau du codon 850 du gène APC et développe spontanément plusieurs adénomes intestinaux à travers l&#39;intestin grêle, du 14 au 16. Imagerie intravitale à long terme de l&#39;intestin est difficile en raison de l&#39;envahissement de la procédure, depuis l&#39;ouverture de la cavité péritonéale est nécessaire pour accéder à l&#39;intestin. Imagerie en temps réel à court terme studies ont déjà été publiés sur l&#39;intestin sain 17,18, mais l&#39;observation directe à long terme des tumeurs intestinales n&#39;a pas été signalée. Une intervention chirurgicale a été conçu et raffiné pour visualiser des tumeurs à travers la surface séreuse de l&#39;intestin, en utilisant le système de microscopie intravitale disque rotatif utilisé auparavant à l&#39;image des tumeurs mammaires 6,10. Dans cet article, un protocole est décrit qui permet de suivre le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs dans l&#39;intestin grêle en utilisant Apc Min / + souris.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Les cellules myéloïdes sont des cellules immunitaires les plus abondants dans les tumeurs et il a été démontré pour favoriser la progression de la tumeur. Techniques d&#39;imagerie intravitale modernes permettent l&#39;observation du comportement cellulaire vivent à l&#39;intérieur de l&#39;organe, mais peut être difficile dans certains types de cancer dû à l&#39;accessibilité d&#39;organes et de la tumeur tels que l&#39;intestin. L&#39;observation directe des tumeurs de l&#39;intestin n&#39;a pas été rapportée précédemment. Une intervention chirurgicale décrite ici permet l&#39;observation directe de la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales chez des souris vivantes en utilisant des souris transgéniques rapporteurs fluorescent et traceurs injectables ou des anticorps. A cet effet, un quatre couleurs, multi-région, micro-lensed disque filature microscope confocal qui permet l&#39;imagerie continue à long terme avec l&#39;acquisition rapide d&#39;images a été utilisé. Apc Min / + souris qui développent de multiples adénomes de l&#39;intestin grêle sont croisés avec des souris c-fms-EGFP pour visualiser les cellules myéloïdes et des souris ACTB-ECFPà visualiser les cellules épithéliales de l&#39;intestin des cryptes. Les procédures pour le marquage de composantes de tumeurs, tels que les neutrophiles et les vaisseaux sanguins, et la procédure de positionnement de la tumeur pour l&#39;imagerie à travers la surface séreuse sont également décrits. Films time-lapse compilées à partir de plusieurs heures de l&#39;imagerie permettent l&#39;analyse du comportement des cellules myéloïdes in situ dans le microenvironnement intestinal.

En utilisant la microscopie confocale disque filage, de tissus non tumoraux et tumorales dans l&#39;intestin grêle de Apc Min / +; ACTB-ECFP; souris c-fms-ECFP peuvent être visualisées à partir de la surface séreuse. Après l&#39;exposition, le logiciel de l&#39;appareil photo est utilisé pour analyser et ajuster l&#39;acquisition (Figure 1 supplémentaire). Après l&#39;administration intraveineuse (iv) l&#39;injection de 2000 kDa fluorescent rhodamine-dextra...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K vues.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Vidéo: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Recherche

Immunologie et infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.