Les auteurs reconnaissent le soutien financier des institutions suivantes: la National Science Foundation (Grant 0.719.232), le Department of Energy (Grant DEFG02-01ER15129), la WM Keck Foundation (Grant 041 904), et l&#39;Université George Washington Fonds pour l&#39;amélioration de la recherche. Les auteurs sont reconnaissants pour les fibres optiques à base GEO2 généreusement fournis par Fiber Systems Infrarouge (Silver Spring, MD), ainsi que pour la première discussion sur le protocole relatif à la gravure en fibre de Mark E. Reeves et Joan A. Hoffmann de l&#39;université George Washington Université. Les auteurs souhaitent également remercier Jessica A. Stolee pour son aide lors de l&#39;enregistrement vidéo de ce protocole.

1. Composants optiques <ol><li> L&#39;ablation laser pour l&#39;ionisation electrospray ablation laser (LAESI) spectrométrie de masse (MS) est produite par un laser à impulsion de 5 ns à 2,94 um de longueur d&#39;onde. Un oscillateur paramétrique optique accordable entraîné par un laser Nd: YAG (Opolette 100, Opotek Inc, Carlsbad, CA) est utilisée pour l&#39;ablation de cette étude. Le taux de redoublement est sélectionné entre 5 et 100 Hz. Ceci est un laser de classe IV qui lors de l&#39;exposition directe peut causer de graves dommages permanents à l&#39;œil ou la peau. La réflexion diffuse du faisceau laser peut également être dangereux pour la peau ou les yeux. Porter une lunette laser approprié de protection. </li><li> La fibre optique en verre à base de dioxyde de germanium a été obtenue à partir Fiber Systems Infrarouge, Inc (Silver Spring, MD). S&#39;il ya Hytrel et de polyimide de revêtements sur la fibre suivez les instructions ci-dessous pour les enlever de la fin. Chauffer 1-méthyl-2-one à 130-150 ° C sous une hotte. Tremper les extrémités des fibres que vous voulez bande dans ce liquide pendant environ 1 minute ou jusqu&#39;à ce que le revêtement commence à ramollir et décoller. Tremper le revêtement ramolli dans du méthanol ou l&#39;isopropanol pendant une minute, et essuyer tout revêtement restant avec une serviette non pelucheuse. Après avoir enlevé le revêtement, cliver les deux extrémités de la fibre avec une lame de saphir (KITCO Fibre Optique, Virginia Beach, Virginie) en marquant et en douceur les enfonçant. </li><li> Pour atteindre la netteté voulue, chimiquement etch une extrémité de la pointe de la fibre de 1% (v / v) d&#39;acide nitrique (qualité réactif) solution. Verticalement plonger l&#39;extrémité de la fibre choisie dans la solution acide à une profondeur de 300 à 500 um après le contact initial. Après environ 15 minutes de la gravure, la pointe spontanément détacher de la surface d&#39;acide. Il en résulte une pointe fibre affûtés avec ~ 15 um de rayon de courbure. Rincer à l&#39;eau désionisée pour éliminer tout résidu d&#39;acide. </li><li> Montez la fin gravé de la fibre sur un micromanipulateur (MN-151, Narishige, Tokyo, Japon) et l&#39;apporter à la proximité (~ 20 um) de la surface des cellules pour le dépôt de l&#39;efficacité énergétique. </li><li> Tenir l&#39;extrémité non gravée de la fibre optique par une fibre nue mandrin (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Pour l&#39;alignement optique, le mandrin de fibre est montée sur un traducteur cinq axes (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). L&#39;énergie du laser (0,5 à 1 mJ) est couplée dans la fibre par la focalisation du faisceau par un fluorure de calcium plano-convexe ou lentilles ZnSe antireflet (infrarouge, produits optiques, de Farmingdale, New York) sur sa non gravée fin. Miroirs d&#39;or protégées (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) sont utilisés pour diriger le faisceau laser moyen IR sur la lentille de focalisation. </li></ol> 2. Configuration électronébulisation <ol><li> Le système peut être construit par électrospray en utilisant les composants suivants: l&#39;union avec embout métallique conducteur perfluoré, raccords, tubes de manches, l&#39;aiguille du port (par exemple, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, respectivement IDEX Health &amp; Sciences, Oak Harbor, WA), ainsi que des tubes de silice fondue (par exemple, CT360-100-50-5, Nouveau Objectif Inc, Woburn, MA). L&#39;émetteur recommandée est faite d&#39;acier inoxydable et a une pointe effilée avec un ID de 50 microns (par exemple, MT320-50-5-5, Nouveau Objectif Inc, Woburn, MA). </li><li> Préparer une solution de méthanol à 50% avec de l&#39;acide acétique à 0,1% (v / v) pour l&#39;électrospray. La solution est pompée à un débit de 200 à 300 nl / min par une pompe seringue (Harvard Apparatus, Holliston, MA) en utilisant, par exemple, un. 500 seringues ul (81222, Hamilton Company, Reno, NV) </li><li> Appliquer à haute tension entre 2800 et 3000 V pour l&#39;union de métal par une alimentation régulée (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) pour générer une électronébulisation stable. Assurez-vous que toutes les connexions électriques sont sécurisés et blindés avec le blindage à la terre. Le contact direct avec la haute tension exposés peut entraîner un choc électrique. </li></ol> 3. Manipulation des échantillons <ol><li> Obtenir le tissu vivant ou d&#39;un échantillon de cellules provenant d&#39;une source appropriée et de les garder comme recommandé avant l&#39;analyse. Les ampoules Allium cepa pour cette démonstration ont été achetés dans un magasin local. Couper une ampoule longitudinalement par un scalpel chirurgical. Un segment de quelques centimètres d&#39;une échelle a été sectionnée en une bande. Une monocouche intacte du tissu interne épidermique est décollée. </li><li> La surface humide de l&#39;épiderme est utilisé pour monter le tissu sur une lame de microscope en verre pré-nettoyés. Tenez la lame par un support de plaque d&#39;usage général (FP01, Thorlabs Inc, Newton, NJ), monté sur une platine de translation à trois axes pour le positionnement. Acquérir les spectres de masse immédiatement après le montage de l&#39;échantillon pour éviter la dégradation des cellules. </li></ol> 4. Visualization System <ol><li> Deux microscopes à longue distance sont utilisés pour sélectionner les cellules d&#39;analyse et de maintenir la distance entre la pointe de la fibre aiguisé et la surface des cellules. Ce dernier est monté sous l&#39;angle 15 ° -30 ° mesuré à partir de la surface. Ce système se compose d&#39;alMicroscope ong vidéo à distance (7x zoom optique de précision, Edmund Optics, Barrington, NJ), avec une infinité 5x corrigées objectif (Apo M Plan de 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japon) équipé d&#39;une caméra CCD (F131 Marlin, Allied Vision Technologies , Stadtroda, Allemagne) pour la surveillance et la capture d&#39;image. </li><li> Le microscope deuxième vidéo est monté à un angle droit de la surface de l&#39;échantillon de visualiser les cellules à partir du haut. Ce système fournit une rétroaction visuelle pour aligner la pointe de la fibre sur la cellule sélectionnée pour l&#39;ablation et l&#39;analyse. Il se compose d&#39;un zoom optique 7x de précision (Edmund Optics, Barrington, NJ), équipé d&#39;un débordement 10x corrigées à long lentille de l&#39;objectif de travail à distance (M Plan d&#39;Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japon) et une caméra CCD. </li></ol> 5. Acquisition des spectres de masse <ol><li> Allumez le laser, l&#39;électronébulisation et le spectromètre de masse, par exemple, un quadripôle à temps de vol du système (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Optimiser la géométrie de la source d&#39;ions LAESI en ajustant la position de la tache de l&#39;ablation et l&#39;émetteur electrospray rapport à l&#39;autre et l&#39;orifice du spectromètre de masse pour atteindre les intensités ioniques maximum. </li><li> Sélectionnez la cellule d&#39;intérêt pour l&#39;analyse en utilisant le système de visualisation haut de vue. Après sélection, déplacez le stade de l&#39;échantillon d&#39;apporter la cellule sélectionnée directement en dessous de la pointe aiguisée de la fibre optique. En utilisant le microscope en vue latérale de réajuster le bout-à-cellule de distance de surface à ~ 20 um. </li><li> Impulsions laser feu à la cellule sélectionnée par la pointe de la fibre gravé. Ce résultat dans la perforation de la paroi cellulaire et l&#39;éjection du cytoplasme sous forme de matières particulaires. Après postionization par l&#39;électronébulisation, les ions produits sont collectées par le spectromètre de masse et les spectres de masse sont enregistrés. </li><li> Après l&#39;acquisition de données, mettre le laser, l&#39;électronébulisation et le spectromètre de masse en mode veille ou éteignez-les. Gardez l&#39;ablation A. échantillon de tissu pour l&#39;observation de la LCPE option par microscopie optique. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs L&#39;ablation réussie d&#39;une seule cellule dans les résultats de l&#39;éclatement de la paroi cellulaire et la collecte d&#39;un spectre de masse LAESI. Une expérience infructueuse résulte habituellement en un rien de l&#39;ablation et / ou pas de spectre de masse. Pour fins de démonstration, nous présentons les résultats de l&#39;analyse LAESI-MS d&#39;une seule cellule épidermique embarqué d&#39;un A. Ampoule de la LCPE. Figure 2a montre une image de microscopie optique représentant après le prélèvement d&#39;une cellule. La paroi cellulaire est perforée et l&#39;étendue de la perforation est limité par les frontières avec les cellules voisines. Les cellules adjacentes semblent être intactes. Figure 2b montre un spectre de masse représentant LAESI produite à partir de la cellule. Une grande variété d&#39;ions sont détectés à partir de la A. cellulaire cepa et basé sur leurs masses exactes, modèles de distribution des isotopes, et, dans certains cas, les spectres de masse en tandem, ils sont provisoirement affectés à des métabolites endogènes. Les ions détectés à partir d&#39;une seule cellule ont été similaires à celles observées dans l&#39;analyse du tissu même par conventionnelles LAESI-MS de plusieurs cellules. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma d&#39;analyse cellulaire unique par LAESI-MS. Une impulsion laser IR mi-est couplée dans une fibre optique et livrés à l&#39;échantillon placé sur lame de verre. La pointe de la fibre aiguisé focalise la lumière dans la cellule cible et l&#39;énergie déposée éclate la cellule. Le panache d&#39;ablation produite (points rouges) est fusionné avec un panache électronébulisation (points noirs) les gouttelettes coalesce (points verts) conduisant à la production d&#39;ions échantillon spécifique. Ces ions sont analysés et détectés par le spectromètre de masse (MS). Deux longs microscopes vidéo à distance, Microscope Microscope 1 et 2, sont utilisés pour contrôler la distance entre la pointe de la fibre et la surface de la cellule et à sélectionner une cellule d&#39;analyse, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="Figure 2a" /> Figure 2a. Ablation marque sur une seule cellule épidermique d&#39;un A. Ampoule de la LCPE. Les cellules adjacentes ne présentent pas de dégâts visibles et par la suite peuvent être analysés séparément. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="Figure 2b" /> Figure 2b Spectre de masse. Correspondant à l&#39;ablation d&#39;un simple A. cepa épidermique cellulaire montre la présence de métabolites primaires et secondaires.

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	<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Mass+Spectrometry.">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li><li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets.">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li><li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI.">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. 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A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , (2010).</li><li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses.">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li></ol>

La teneur en eau du cytoplasme des cellules et la résistance à la traction de la paroi cellulaire ou la membrane sont des facteurs critiques qui régissent l&#39;ablation des cellules individuelles pendant LAESI-MS. La fluence laser doit être ajustée pour atteindre les seuils d&#39;ablation des différents types de cellules. La fluence laser livré dépend de l&#39;énergie de l&#39;impulsion laser et de la distance entre la pointe de la fibre et la surface des cellules. Minimiser la perturbation des cellules voisines lors de l&#39;analyse unicellulaire est critique. Garder l&#39;énergie du laser au seuil d&#39;ablation limite l&#39;effet des analyses sur les cellules adjacentes. Une des applications possibles est d&#39;utiliser des cellules individuelles que les pixels naturelles volumétrique (voxels) pour Imagerie chimique par la SP. Par rapport à la collecte de données sur une grille artificielle souvent rectangulaire, imagerie chimique d&#39;un tissu, une cellule à une époque est plus susceptible de conserver l&#39;organisation spatiale des interactions biochimiques entre les cellules.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>45727</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>65548</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M79603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>39259</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct analysis of single cells by mass spectrometry at atmospheric pressure

Analyse des produits biochimiques dans des cellules individuelles est importante pour comprendre le métabolisme cellulaire, cycle cellulaire, l&#39;adaptation, les états pathologiques, etc Même les types de cellules présentent la même composition biochimique hétérogènes en fonction de leurs conditions physiologiques et les interactions avec l&#39;environnement. Les méthodes classiques de spectrométrie de masse (MS) utilisé pour l&#39;analyse des biomolécules dans des cellules individuelles reposent sur longue préparation des échantillons. Suppression des cellules de leur environnement naturel et de traitement des échantillons approfondie pourrait conduire à des changements dans la composition cellulaire. Méthodes d&#39;ionisation ambiante permettant l&#39;analyse des échantillons dans leur environnement naturel et sans longue préparation des échantillons. 1 Les techniques basées sur l&#39;infrarouge moyen (mi-IR) par ablation laser des matériaux biologiques à 2,94 um de longueur d&#39;onde d&#39;excitation utiliser la soudaine d&#39;eau que les résultats en phase explosion. 2 techniques d&#39;ionisation ambiante basées sur le rayonnement laser IR moyen, comme d&#39;ionisation électrospray ablation laser (LAESI) et la pression atmosphérique infrarouge laser assistée par matrice désorption-ionisation (AP IR-MALDI), ont démontré avec succès la capacité d&#39;analyser directement l&#39;eau tissus riches et les liquides biologiques à la pression atmosphérique. 3-11 En LAESI le panache mi-IR d&#39;ablation laser qui se compose essentiellement de particules neutres de la coalescence des gouttelettes d&#39;échantillon electrospray très chargé pour produire des ions. Récemment, mi-IR ablation des cellules individuelles a été réalisée en fournissant le rayonnement IR moyen par une fibre gravé. Le panache généré par cette ablation était postionized par un electrospray permettant l&#39;analyse des métabolites variés dans des cellules individuelles par LAESI-MS 12. Cet article décrit le protocole détaillé pour l&#39;analyse cellulaire unique en utilisant LAESI-MS. La vidéo présentée montre l&#39;analyse d&#39;une seule cellule épidermique de la peau d&#39;une ampoule de Allium cepa. Le schéma du système est montré dans la figure 1. Un exemple représentatif de l&#39;ablation seule cellule et un spectre de masse LAESI de la cellule sont fournis dans la Figure 2.

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Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analyse cellulaire unique est effectué par spectrométrie de masse sur les cellules végétales et animales à la pression atmosphérique en utilisant une fibre optique pour l&#39;échantillon aiguisé les cellules pour l&#39;ionisation electrospray ablation laser (LAESI) spectrométrie de masse.

Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

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Biology

15.9K vues.  George Washington University. Analyse cellulaire unique est effectué par spectrométrie de masse sur les cellules végétales et animales à la pression atmosphérique en utilisant une fibre optique pour l'échantillon aiguisé les cellules pour l'ionisation electrospray ablation laser (LAESI) spectrométrie de masse.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pression atmosphérique imagerie moléculaire des tissus biologiques et biofilms par spectrométrie de masse LAESI

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amide hydrogène / deutérium Analyse Bourse &amp; MALDI-TOF spectrométrie de masse de PAK2 activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d&#39;analyse dans les conditions ambiantes

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Préparation des échantillons pour l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse des microvaisseaux oculaires

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...