Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier de ce travail par la US National Science Foundation Grant No. 0719232 sous, par le US Department of Energy (DEFG02-01ER15129), et par Protea Biosciences, Inc (Morgantown). Les auteurs souhaitent également remercier Jessica A. Stolee pour son aide lors de l&#39;enregistrement vidéo de ce protocole.

Le protocole suivant décrit les principales étapes de l&#39;ionisation électrospray ablation laser (LAESI) expérimenter et fournit des exemples représentatifs des latéraux et en trois dimensions (3D) d&#39;imagerie pour animaux et des échantillons de tissus végétaux. D&#39;autres détails expérimentaux et technique peuvent être obtenus auprès d&#39;ailleurs 1-6. 1. Préparation des tissus et de montage <ol><li> Si la coupe est nécessaire, utilisez un cryomicrotome à la section du tissu dans 10 à 100 um d&#39;épaisseur à -10 à -20 ° C, sauf indication recommandée pour un type de tissu particulier. </li><li> Mont sections sur une surface plane (par exemple, chimiquement lame de verre pré-nettoyés) directement, sans modificateurs chimiques. Pour les tissus sectionnés, dégel monter les sections et fixer le support de l&#39;échantillon à une étape de refroidissement Peltier immédiatement après le dégel de montage pour maintenir le tissu congelé en tout temps durant l&#39;analyse. Cette étape est nécessaire pour minimiser / éviter la migration moléculaire dans la section. </li><li> Si nécessaire, utilisez un dissipateur thermique équipé d&#39;un ventilateur de faible puissance pour faciliter l&#39;élimination de la chaleur à partir du stade de Peltier pour maintenir le tissu congelé. </li><li> Dans un environnement humide pendant une période prolongée de temps (1-2 heures), inspecter pour la condensation de l&#39;eau ou de glace sur la surface du tissu. Condensation d&#39;eau sur le tissu affecte négativement les performances d&#39;imagerie dans des expériences LAESI 1. </li><li> Si nécessaire, utilisez un déshumidificateur pièce ou un endroit de l&#39;échantillon refroidi dans une chambre environnementale rempli d&#39;un gaz inerte (par exemple, du gaz azote sec) pour éviter la condensation. 1 </li></ol> 2. Optimisation de la source d&#39;ions LAESI La source d&#39;ions LAESI compose d&#39;un laser infrarouge moyen, une série d&#39;éléments optiques pour la direction légère et se concentrer ainsi que des porte-échantillons supplémentaires, des composants de refroidissement, les étapes de la traduction, et un système de distribution du solvant. La figure 1 montre l&#39;arrangement typique de ces éléments par rapport à l&#39;entrée de la source d&#39;ions à pression atmosphérique d&#39;un spectromètre de masse. <ol><li> Comme l&#39;illustre la figure 1, la position de l&#39;échantillon de 15 à 20 mm en dessous de l&#39;orifice du cône d&#39;échantillonnage spectromètre de masse (d ou-PF). </li><li> Fonctionner un laser infrarouge à la mi-longueur d&#39;onde 2,94 um et 10 Hz taux de répétition. Atténuer la sortie du laser à ~ 100 μJ / impulsion d&#39;énergie. </li><li> Utiliser une combinaison de miroirs d&#39;or et une lentille de focalisation transparente à la longueur d&#39;onde laser (par exemple, un plan-convexe CaF 2 ou ZnSe lentille) de coupler l&#39;énergie d&#39;impulsion laser dans l&#39;échantillon à incidence normale (voir l&#39;angle d&#39;incidence droite par rapport à la surface de l&#39;échantillon dans la figure 1). </li><li> Position de la mi-infrarouge axe du faisceau de 5-8 mm de l&#39;avant de l&#39;orifice du cône d&#39;échantillonnage spectromètre de masse. </li><li> Ajustez la position et la lentille de focalisation de l&#39;énergie d&#39;impulsion du faisceau laser pour réaliser l&#39;enlèvement de tissus dans la tache focale. Les dimensions du volume ablation déterminer le pixel (ou voxel dans l&#39;imagerie tridimensionnelle) de taille pour les applications d&#39;imagerie. </li><li> Position d&#39;un émetteur nanospray en ligne avec l&#39;axe d&#39;entrée du spectromètre de masse et à une distance pointe orifice-émetteur d&#39;environ 10 mm (voir figure 1). </li><li> Pour l&#39;électrospray, préparer la solution de méthanol à 50% avec de l&#39;acide acétique à 0,1% ou 0,1% d&#39;additif acétate d&#39;ammonium pour le mode d&#39;ions positifs ou négatifs, respectivement. Selon l&#39;échantillon, d&#39;autres solvants organiques, tels que l&#39;acétonitrile, isopropanol, etc, peut remplacer le méthanol à des concentrations appropriées pour la tâche analytique. La stabilité de l&#39;électrospray est cruciale pour l&#39;imagerie de succès. Selon le choix du solvant, le débit et la tension de pulvérisation doivent être ajustés pour obtenir de pulvérisation stable. </li><li> Pour réactive LAESI 6 dans les applications de l&#39;imagerie, la solution peut contenir electrosprayed réactifs. </li><li> Utiliser une pompe seringue pour fournir la solution d&#39;électronébulisation travers l&#39;émetteur electrospray à un débit d&#39;environ 300 Nl / min. </li><li> Si l&#39;orifice du spectromètre de masse est maintenu à une basse tension (&lt;500 V mesurée par rapport au sol), de générer electrospray en appliquant une tension élevée directement à l&#39;émetteur par électronébulisation (par exemple, 3000 V) ou par un syndicat de la métallurgie. Sinon, sol directement de l&#39;émetteur ou par l&#39;intermédiaire d&#39;électronébulisation syndicat de la métallurgie à établir électrospray. </li><li> Actionner la source électrospray dans le cône de pulvérisation à jet mode pour la génération d&#39;ions les plus efficaces par LAESI. Pour l&#39;effet des variables d&#39;exploitation sur les modes de pulvérisation et leur effet sur ​​les spectres de masse, voir les discussions ailleurs. 5,7,8 </li><li> Ajustez soigneusement les distances relatives de la configuration LAESI pour optimiser le rendement LAESI ions tout en gardant le faisceau laser, l&#39;émetteur, et les axes orifice dans le même plan. S&#39;il vous plaît trouver des instructions détaillées ailleurs. 5 </li><li> Avec un microscope optique, de déterminer les dimensions latérales du cratère d&#39;ablation de l&#39;échantillon. </li><li> Pour en trois dimensions des expériences d&#39;imagerie LAESI, effectuer l&#39;ablation d&#39;impulsions individuelles et de déterminer la profondeur d&#39;un voxel en utilisant, par exemple, le mode Z-stack en microscopie optique. 3 </li></ol> 3. Imagerie moléculaire et l&#39;analyse de données Dans l&#39;expérience d&#39;imagerie, l&#39;échantillon de tissu est déplacé dans le plan focal du laser dans les directions X et Y avec des tailles de pas plus grand que ou égal à la dimension de la tache de l&#39;ablation. La résolution spatiale est limitée par la focalisation du faisceau laser incident. <ol><li> Sélectionnez la zone d&#39;intérêt sur la surface de l&#39;échantillon et d&#39;obtenir les (X, Y) les coordonnées des limites correspondantes. </li><li> Choisissez un algorithme de maillage (par exemple, la grille adaptative, l&#39;imagerie région sélectionnée, grille rectangulaire, motif en spirale, Z numérisation, etc) avec lequel raster surface de l&#39;échantillon avec un certain temps d&#39;arrêt sur chaque pixel sur la zone à imager. </li><li> Utilisez une platine de translation à trois axes et le logiciel qui est capable de tramage de l&#39;échantillon en fonction de la grille préétablie. </li><li> Calculez le temps total nécessaire pour l&#39;imagerie. </li><li> Désactiver le délai d&#39;acquisition des données du spectromètre de masse. Si cela n&#39;est pas possible, fixer le délai d&#39;acquisition de données à la valeur calculée imagerie en temps. </li><li> Démarrer la source laser infrarouge moyen à un taux de répétition correcte de produire suffisamment de signal-bruit dans le spectre de masse dans le temps de séjour à chaque pixel d&#39;effectuer une expérience d&#39;imagerie LAESI latérale. Pour l&#39;imagerie moléculaire en 3D, l&#39;utilisation d&#39;un taux d&#39;acquisition de spectre plus élevé que le taux de redoublement source laser au succès de masse analyser les ions générés au sein d&#39;une seule impulsion laser. Attendez le signal START pour lancer la séquence de l&#39;ablation. </li><li> Allumez la source électrospray. Assurez-vous qu&#39;il ya assez de solution pour le temps plein requis pour l&#39;imagerie. </li><li> Simultanément lancer l&#39;acquisition des spectres de masse, l&#39;ablation laser mi-IR, et le balayage de surface. </li><li> Lorsque l&#39;exécution d&#39;imagerie est terminée, arrêter le balayage de surface, le laser mi-IR, et l&#39;acquisition de données. </li><li> Désactiver la source laser. </li><li> Éteignez la haute tension. </li><li> Eteindre la pompe seringue. </li><li> Régler le spectromètre de masse en mode veille. </li><li> Éteignez l&#39;électronique Peltier-refroidissement. </li><li> Fermer flux de gaz inerte s&#39;il est utilisé. </li><li> Utilisez un logiciel de corréler les coordonnées absolues des pixels de l&#39;imagerie latérale ou les voxels dans l&#39;analyse 3D avec les spectres correspondants. </li><li> Tracer le signal d&#39;intensité d&#39;ions sélectionnés pour une valeur m / z contre les coordonnées absolues d&#39;analyse pour obtenir des images 3D latérale et moléculaire. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 2 donne des résultats représentatifs pour certains types de tissus majeurs et les modalités d&#39;imagerie. Panel A représente un cas pour une coupe de tissu animal qui a été gelé pendant l&#39;expérience pour éviter la déshydratation. 1 En outre, l&#39;échantillon a été localisé dans un environnement de gaz azote sec pour éviter les vapeurs de l&#39;eau ambiante de condensation sur la surface de l&#39;échantillon. Une section de 100 um d&#39;épaisseur coronale d&#39;un cerveau de rat (Rattus norvegicus) est latéralement imagées avec LAESI. Les régions anatomiques du cerveau (voir image optique dans le panneau A) montrent une bonne corrélation avec l&#39;image moléculaires obtenues pour le PC plasmalogènes (O-33: 3) et / ou PE (O-36: 3) avec m / z 728,559. Groupe B montre l&#39;imagerie 3D LAESI d&#39;une usine de Zebra (Aphelandra squarrosa) tissus de la feuille. Parce que les feuilles possèdent un mécanisme de défense naturelle contre la déshydratation, l&#39;échantillon pourrait être interrogé dans le milieu ambiant. 3 Les images 3D obtenues moléculaire a révélé une variété de modèles de distribution pour les métabolites primaires et secondaires. Entre autres, acacetin avec m / z 285,076 a été détectée à compte d&#39;ions élevés dans les secteurs de jaune de la deuxième et troisième couches par le haut avec une répartition homogène dans les autres. Cette distribution d&#39;accord avec le modèle de la panachure vu dans l&#39;image optique. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma du système LAESI (ES, pointe émetteur électronébulisation; OU, l&#39;orifice du cône de prélèvement du spectromètre de masse; Floride, la lentille de focalisation; PF, point focal; P, refroidissement par effet Peltier étape; du SH, dissipateur de chaleur). Une partie de la matière particulaire expulsés pendant la mi-IR d&#39;ablation (points rouges) fusionne avec l&#39;electrospray à céder gouttelettes chargées ensemencé avec des molécules et des ions de l&#39;échantillon (points verts). Les ions libérés par ces gouttelettes sont analysés et enregistrés par le spectromètre de masse. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les résultats représentatifs pour les latérales et 3D imagination. ng avec LAESI spectrométrie de masse (A) Le panneau supérieur représente l&#39;image optique d&#39;un cerveau de rat (Rattus norvegicus) coupe coronale et l&#39;image moléculaires obtenues pour le PC plasmalogènes (O-33: 3) et / ou PE (O-36 : 3) avec m / z 728,559. La barre d&#39;échelle blanche correspond à 1 mm. Adapté avec la permission de (référence 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Le panneau du bas montre l&#39;imagerie 3D d&#39;une feuille d&#39;un panaché des plantes Zebra (Aphelandra squarrosa). Acacetin avec m / z 285,076 a été détectée à compte d&#39;ions élevés dans les secteurs de jaune de la deuxième et troisième couches par le haut avec une répartition homogène dans les autres. Reproduit avec la permission de (référence 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol>
	<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li><li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure,+in+vivo,+and+imaging+mass+spectrometry.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li><li>Nemes, P., Vertes, A., Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure+molecular+imaging+mass+spectrometry.+Mass+Spectrometry+Imaging.">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry.">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li><li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays.">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li><li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization.">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li><li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry.">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li><li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+mass+spectrometry.">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li></ol>

Différents types de tissus présentent des contenus différents de l&#39;eau et de résistance à la traction, ce qui, à son tour, peut affecter les caractéristiques d&#39;ablation des échantillons. 9 Afin d&#39;atténuer ces effets, il est souhaité que les protocoles de la fluence laser, la manipulation des échantillons et l&#39;analyse seront révisées lors du changement entre types de tissus majeurs. Pour seule cellule ou d&#39;enquêtes à plus haute résolution, la lumière infrarouge moyen peut être couplée dans une fibre optique aiguisé au lieu d&#39;une lentille de focalisation 10. En positionnant la pointe de la fibre à proximité des cellules sélectionnées dans un tissu, d&#39;analyse LAESI peut être effectuée sur un niveau unicellulaire. Comme une étiquette sans source d&#39;ions pour la spectrométrie de masse à ionisation ambiante, 11 LAESI a montré un grand potentiel pour l&#39;étude des processus biochimiques dans les tissus. Avec l&#39;avantage supplémentaire d&#39;une analyse directe, d&#39;imagerie latérale et 3D, LAESI est un nouvel outil de bioanalyse pour le profilage ainsi que les applications d&#39;imagerie.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mass spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters Co. (Milford, MA)</td>
<td>Q-TOF Premier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mid-IR laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td>
<td>Vibrant IR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

atmospheric-pressure molecular imaging of biological tissues and biofilms by laesi mass spectrometry

Méthodes d&#39;ionisation en spectrométrie de masse ambiante permettre des investigations analytiques pour être effectuée directement sur un tissu ou un biofilm sous-natifs, comme des conditions expérimentales. Electrospray ionisation laser ablation (LAESI) est un tel développement et est particulièrement bien adapté pour l&#39;enquête de l&#39;eau contenant des spécimens. LAESI utilise un faisceau laser dans l&#39;infrarouge moyen (2,94 um de longueur d&#39;onde) pour exciter les molécules d&#39;eau de l&#39;échantillon. Lorsque le seuil d&#39;ablation influence est dépassée, l&#39;échantillon est expulsé sous forme de matières particulaires et ces projectiles de voyage à des dizaines de millimètres au-dessus de la surface de l&#39;échantillon. En LAESI, ce panache d&#39;ablation est intercepté par des gouttelettes hautement chargées de capter une fraction de l&#39;échantillon éjecté et convertir ses constituants chimiques en phase gazeuse des ions. Un spectromètre de masse équipé d&#39;une interface à pression atmosphérique source d&#39;ions est employé pour analyser et enregistrer la composition des ions libérés originaires de la zone sondée (pixel) de l&#39;échantillon. Une interrogation systématique sur un tableau de pixels ouvre une voie pour l&#39;imagerie moléculaire dans le mode analyse à la microsonde. Un aspect unique de l&#39;imagerie par spectrométrie de masse est LAESI profils en profondeur qui, en combinaison avec l&#39;imagerie latérale, permet en trois dimensions (3D) d&#39;imagerie moléculaire. Avec actuelle des résolutions latérales et en profondeur de ~ ~ 100 um et 40 um, respectivement, l&#39;imagerie par spectrométrie de masse LAESI permet d&#39;explorer la structure moléculaire des tissus biologiques. Ici, nous passons en revue les principaux éléments d&#39;un système de LAESI et fournir des directives pour une expérience d&#39;imagerie réussie.

Watch this Scientific Journal Video about Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry at JoVE.com

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Electrospray ionisation laser ablation (LAESI) est une source d&#39;ions à pression atmosphérique pour la spectrométrie de masse. Dans le mode d&#39;imagerie, une sonde laser à infrarouge moyen des distributions de molécules à travers une section de tissu ou d&#39;un biofilm. Cette technique présente une nouvelle approche pour les diverses études bioanalytiques réalisées dans le cadre natif des conditions expérimentales.

Pression atmosphérique imagerie moléculaire des tissus biologiques et biofilms par spectrométrie de masse LAESI

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  George Washington University. Electrospray ionisation laser ablation (LAESI) est une source d'ions à pression atmosphérique pour la spectrométrie de masse. Dans le mode d'imagerie, une sonde laser à infrarouge moyen des distributions de molécules à travers une section de tissu ou d'un biofilm. Cette technique présente une nouvelle approche pour les diverses études bioanalytiques réalisées dans le cadre natif des conditions expérimentales.

Vidéo: Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d&#39;analyse dans les conditions ambiantes

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi and trans-Golgi network. Cellular functions of the Golgi are determined by the characteristic distribution of its resident proteins. The spatial resolution of conventional light microscopy is too low to resolve sub-Golgi structure or cisternae. Thus, the immuno-gold electron microscopy is a method of choice to localize a protein at the sub-Golgi level. However, the technique and instrument are beyond the capability of most cell biology labs. We describe here our recently developed super-resolution method called Golgi protein localization by imaging centers of mass (GLIM) to systematically and quantitatively localize a Golgi protein. GLIM is based on standard fluorescence labeling protocols and conventional wide-field or confocal microscopes. It involves the calibration of chromatic-shift aberration of the microscopic system, the image acquisition and the post-acquisition analysis. The sub-Golgi localization of a test protein is quantitatively expressed as the localization quotient. There are four main advantages of GLIM; it is rapid, based on conventional methods and tools, the localization result is quantitative, and it affords ~ 30 nm practical resolution along the Golgi axis. Here we describe the detailed protocol of GLIM to localize a test Golgi protein.

The precise localization of Golgi residents is essential for understanding the cellular functions of the Golgi. However, conventional optical microscopy is unable to resolve the sub-Golgi structure. Here we describe the protocol for a conventional microscopy based super-resolution method to quantitatively determine the sub-Golgi localization of a protein.

Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...