The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

NOTE: La procédure peut être effectuée sur les tissus frais ou surgelés. Nous vous recommandons de perfuser les tissus fortement vascularisés avec PBS au moment de la dissection d&#39;éliminer les globules rouges et les protéines plasmatiques. Nous ne recommandons pas la conduite de la procédure sur les tissus fixes que la fixation (c.-à-réticulation chimique) interfère avec décellularisation et peut également compromettre significativement l&#39;analyse subséquente de la spectrométrie de masse. Pour l&#39;ensemble de la procédure, nous recommandons l&#39;utilisation de tubes à faible rétention et embouts de pipette afin de maximiser la récupération des protéines et peptides. 1. Décellularisation de tissus ou de tumeurs NOTE: Avant de commencer, préparer les réactifs et ajouter des inhibiteurs de la protéase (fournies avec le kit d&#39;extraction de protéines Compartiment) pour le volume souhaité de chaque tampon. Tous les tampons et les échantillons doivent être conservés dans la glace pour la durée de l&#39;expérience à l&#39;exception du tampon CS qui doit être conservé à température ambiante pour éviter SDS Précipitationsitation. NOTE: Le protocole utilise une série d&#39;incubation dans des tampons de différents pH et contenant différentes quantités de sels et des détergents pour séquentiellement protéines intracellulaires d&#39;extraction et d&#39;enrichir de protéines de la MEC insolubles (Figure 1, Tableau 1; voir également la discussion des alternatives à l&#39;utilisation de la kit commercial détaillé ici). Les volumes de réactifs donnés ci-dessous sont pour 100 mg de tissus ou de tumeurs (voir le tableau 1) et doivent être ajustées de manière appropriée. <ol><li> Homogénéiser 100 mg de tissu dans 500 pi de tampon C contenant des inhibiteurs de protease en utilisant un homogénéiseur de tissu jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement perturbé et une suspension homogène. NOTE: Ajouter la désoxyribonucléase I (concentration finale: 200 ug / ml, reconstitué conformément aux instructions du fabricant) et ribonucléase A (concentration finale: 20 pg / ml, reconstitué conformément aux instructions du fabricant) àBuffer N. </li><li> Extraction séquentielle de protéines solubles intracellulaires <ol><li> L&#39;extraction des protéines cytosoliques. Incuber l&#39;homogénat sur un rotateur de tube pendant 20 min à 4 ° C. Enregistrer une petite aliquote (10 pi à 20 pi) de l&#39;homogénat pour l&#39;analyse western blot ultérieure (voir la section Résultats attendus et la figure 2). </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant dans un tube propre, ce qui constitue la fraction cytosolique (C) de l&#39;analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C. </li><li> Pour laver, remettre le culot dans 400 pi de tampon W contenant des inhibiteurs de la protéase et incuber l&#39;échantillon sur un rotateur de tubes pendant 20 min à 4 ° C. Centrifuger l&#39;homogénat à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Pour extraire les protéines nucléaires, remettre en suspension le culot dans 150 pl de tampon de N contenant des inhibiteurs de protéase, deoxyribonucleaSE I et la ribonucléase A et incuber l&#39;échantillon sur un rotateur de tubes pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à 4 ° C et recueillir le surnageant dans un tube propre. Répéter cette étape une fois: après centrifugation de l&#39;échantillon pour la seconde fois, le surnageant ajouter au surnageant précédent: cela constituera la (N) de la fraction nucléaire analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C. Ensuite, effectuez les lavages comme pour l&#39;étape 1.2.3. </li><li> Pour extraire les protéines membranaires, remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon M contenant des inhibiteurs de protease et on incube l&#39;échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 30 min à 4 ° C. Centrifuger l&#39;échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à 4 ° C </li><li> Récupérer le surnageant dans un tube propre: ceci constitue la fraction membranaire (M) de l&#39;analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C. </li><li> Pour extraire les protéines du cytosquelette, resuspendre le culot dans 200 ul de tampon contenant les inhibiteurs de protéase CS et mettre en incubation l&#39;échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 30 min à TA. Notez que le culot ne sera pas dissoudre complètement. Nous vous suggérons de perturber le culot par pipetage de haut en bas jusqu&#39;à ce que l&#39;observation des perturbations de la pastille. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 16 000 xg pendant 30 min à température ambiante. Recueillir le surnageant dans un tube propre. Remarque à ce point une diminution plus marquée de la taille de la pastille (voir la vidéo). </li><li> Remettre en suspension le culot dans 150 pl contenant des inhibiteurs de la protéase du tampon C et incuber l&#39;échantillon sur un dispositif de rotation du tube pendant 20 min à 4 ° C. Centrifuger l&#39;échantillon à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir le surnageant et l&#39;ajouter à la surnageant précédente: cela constituera la fraction du cytosquelette (CS) de l&#39;analyse western blot. Flash geler cette fraction et conserver à -80 ° C. </li><li> Effectuer lavages supplémentaires. Remettre en suspension le culot dans 500 pl de PBS contenant des inhibiteurs de protease ae incuber l&#39;échantillon sur un rotateur de tubes pendant 5 min à 4 ° C. Centrifuger l&#39;échantillon à 16 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Répétez cette étape trois fois. NOTE: Toutes les traces de détergents doivent être éliminés par des lavages poussés avant la digestion des protéines en peptides (voir section 3). À ce stade, le culot ECM enrichi peut être éclair congelées et conservées à -80 ° C. Notez que la taille de la pastille va dépendre de la quantité de protéines (ECM) insolubles dans la matière de départ et l&#39;efficacité de la décellularisation. </li></ol></li></ol> 2. Surveillance de la Qualité de l&#39;Décellularisation / ECM enrichissement par SDS-PAGE et Western Blot <ol><li> Mélanger 10-20 ul aliquote de l&#39;extrait total du tissu et des aliquots de 50 ul de fractions intermédiaires avec Laemmli tampon contenant 100 mM de DTT. Reprendre le, fraction insoluble ECM-enrichi en 3x Laemmli tampon contenant 100 mM de DTT. Remarque: il a élevé des concentrationsde la TNT et du SDS aider à la solubilisation des protéines ECM qui sont relativement insolubles. </li><li> Séparer les protéines par SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose. </li><li> Effectuer immunitaires-taches en utilisant des anticorps pour surveiller les protéines représentant de chacun des cytosoliques, nucléaires, membrane, cytosquelette et ECM fractions (voir la section Résultats Représentant, tableau 2 et figure 2). </li></ol> 3. digestion des protéines à des peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse dans la solution NOTE: Le culot obtenu après la procédure de décellularisation et l&#39;enlèvement de SDS est fortement enrichie en protéines de la MEC insolubles pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse de ces protéines ont besoin d&#39;être digéré en peptides. On notera que, du fait de l&#39;insolubilité des protéines ECM, il est impossible pour l&#39;étape de mesurer la concentration en protéine de l&#39;échantillon. Nous fournissons donc des volumes de réactifs à digérer l&#39;ECM-enriCHED peptides dans des échantillons en fonction de la taille (mm) ou de poids sec de la pastille ECM enrichi (tableau 3). Les solutions de bicarbonate d&#39;ammonium, de l&#39;urée, de la TNT, iodoacétamide et l&#39;acide trifluoroacétique tous doivent être fraîchement préparé. <ol><li> Remettre en suspension l&#39;échantillon d&#39;ECM enrichi en ajoutant le volume approprié de l&#39;urée 8 M à la pastille d&#39;ECM enrichi et ajouter du DTT à une concentration finale de 10 mM (voir tableau 3). Incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C. REMARQUE: à ce stade, les protéines de la MEC ne seront pas entièrement dissous et les visiblement de grosses particules de protéines ne doivent pas être jetés par centrifugation ou filtration. La suspension sera clairement sur déglycosylation et la digestion (voir la vidéo). </li><li> Alkylation <ol><li> Préparer la solution de iodoacétamide dans l&#39;eau de qualité HPLC. Refroidir l&#39;échantillon à température ambiante et ajouter l&#39;iodoacétamide à une concentration finale de 25 mM. Pour alkylation terminée, le DTT: rapport de l&#39;iodoacétamide doit se situer entre 1: 2.5 et 1: 3. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Déglycosylation: Note: déglycosylation est nécessaire pour supprimer des chaînes latérales glucidiques qui interfèrent avec l&#39;identification des peptides modifiés par glycosylation liés en N. <ol><li> Diluer à 2 M d&#39;urée avec 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium pH 8,0 et ajouter la quantité appropriée de PNGaseF (voir tableau 3). Incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C. </li></ol></li><li> Digestion <ol><li> Ajouter Lys-C et incuber avec agitation continue à 1400 tours par minute pendant 2 heures à 37 ° C. Ajouter la trypsine et incuber avec agitation continue à 1400 rpm O / N à 37 ° C. REMARQUE: la suspension de l&#39;ECM-riche qui a commencé trouble lors de la reconstitution initiale dans l&#39;urée 8M apparaît clair après O / N digestion (voir la vidéo). </li><li> Ajouter une deuxième aliquote de la trypsine à l&#39;échantillon et incuber, sous agitation continue à 1400 tours par minute pendant encore 2 heures à 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Acidification <ol><li> Après achèvement de la digestion, inactiver la trypsine en acidifiant l&#39;échantillon fraîchement préparée avec 50% d&#39;acide trifluoro-acétique (TFA). L&#39;échantillon devrait atteindre un pH &lt;2. Nous suggérons l&#39;ajout de 1-1,5 ul de TFA à 50% à un moment et en utilisant 1 pl de la solution de peptide pour mesurer le pH de la solution en utilisant du papier pH (voir la vidéo). </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon acidifié à 16 000 xg pendant 5 min à température ambiante. Recueillir le surnageant dans un tube à faible rétention propre. À ce stade, la solution de peptide peut être conservé à -20 ° C. </li></ol></li><li> Dessalage Remarque: cette dernière étape est habituellement réalisée à une installation de spectrométrie de masse selon leurs propres méthodes préférées. <ol><li> Avant l&#39;analyse protéomique, dessaler les échantillons et les peptides élues avec fraîchement préparée de 60% d&#39;acétonitrile, l&#39;acide trifluoroacétique à 0,1%, suivie d&#39;une concentration dans un concentrateur sous vide. Reprendre les peptides dans fraîchement préparé 3% acetonitrile, 0,1% d&#39;acide trifluoroacétique 8. REMARQUE: après que le dessalage, la concentration de la solution de peptide peut être mesurée par spectrophotométrie (voir la section résultats attendus). </li><li> Maintenant analyser l&#39;échantillon par spectrométrie de masse, de nouveau conformément aux modes opératoires optimaux de l&#39;installation de spectrométrie de masse. NOTE: Nous encourageons les chercheurs intéressés à caractériser la composition des ECM en utilisant la spectrométrie de masse pour se référer à nos autres publications 8 - 10 et le site Web qui fournissent des explications plus détaillées, y compris les paramètres LC-MS / MS, la recherche de masse de données de spectrométrie pour l&#39;identification et les données de protéines analyse utilisant le silico matrisome outil d&#39;annotation, nous avons développé en 8. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Modifications Bien que nous avons utilisé cette procédure exacte à enrichir l&#39;ECM de dix tissus et types de tumeurs 8 - 10, des modifications du protocole devrait être considérée dans les cas suivants: 1) Détection de protéines de la MEC dans les fractions intermédiaires. Matrices extracellulaires provenant de différents tissus ou types de tumeurs peuvent différer dans leur extractibilité / insolubilité, comme discuté ci-dessus pour la fibronectine et laminines. Par exemple, on pense que la MEC des tissus ou des tissus fibrotiques remodelage retourne très dynamique et donc on pourrait observer une plus grande proportion de protéines de la MEC dans les tissus d&#39;être plus facilement extractible 12. En fonction de la fraction de protéines de la MEC qui sont détectés, nous suggérons de réduire le temps d&#39;incubation de l&#39;étape consistant à provoquer l&#39;extraction des protéines de la MEC ou omettre cette étape. 2) DÉTECTION d&#39;une partie importante des composants intracellulaires dans le culot enrichi ECM. Dans certains tissus ou types de tumeurs des cellules de rapport: ECM est particulièrement élevées (par exemple, les tumeurs, le foie, la rate, la non-desmoplastiques). Dans ce cas, une contamination importante de la fraction enrichie de l&#39;ECM par des protéines intracellulaires (en particulier des protéines et / ou des histones cytosquelette) peut être observée. Pour épuiser les protéines intracellulaires efficacement, nous vous suggérons de répéter deux fois l&#39;incubation dans le tampon M et / ou tampon CS (les deux détergents contenant, ce épuise généralement abondantes protéines intracellulaires). Une autre alternative serait d&#39;utiliser des tampons de rechange avec des concentrations plus élevées de détergents, avec l&#39;avertissement que cela peut conduire à l&#39;épuisement des protéines ECM relativement plus solubles ainsi (voir paragraphe suivant). 3) Alternative à l&#39;aide d&#39;un kit commercial. Nous avons été incapables, pour des raisons de propriété, pour obtenir la composition précise des tampons frosuis le fournisseur du kit d&#39;extraction de protéines et compartimentés. Toutefois, nous avons inclus dans le tableau 1 notes basées sur notre propre expérience en utilisant des tampons faits maison avec du détergent défini (NP-40, désoxycholate de sodium et SDS) les concentrations de procéder à des extractions similaires. Une étude récente a également souligné l&#39;importance du pH des tampons de décellularisation de conserver protéines ECM 13. Limites de la technique La méthode présentée ici repose sur le fait que les protéines de l&#39;ECM sont intrinsèquement plus insoluble que la plupart des protéines intracellulaires. Cependant, le procédé décrit ici de décellularisation extrait certainement composants solubles présents dans la MEC telles que des facteurs de croissance ou des enzymes de remodelage de la MEC. Bien que les protéines d&#39;ECM associé étroitement liés aux protéines d&#39;ECM ont été détectés par la protéomique dans les échantillons préparés comme décrit, cette méthode peut être trop strictes au profil totalement la composition de matrisome-associéprotéines. L&#39;importance de la technique par rapport à d&#39;autres méthodes L&#39;avantage de la méthode présentée ici par rapport aux autres procédés est qu&#39;il peut être adapté à la nature de l&#39;intérêt de l&#39;ECM: les étapes intermédiaires peut être omis ou répété pour empêcher la perte de protéines de la MEC ou augmenter l&#39;épuisement des protéines contaminantes intracellulaires respectivement. Cette méthode utilise également seulement des quantités minimales de produits de lavage qui sont rincés à empêcher leur interférence avec la préparation du peptide suivant et spectrométrie de masse. Enfin, le procédé décrit ici pour digérer les préparations de protéines ECM riche en peptides a également l&#39;avantage de ne pas nécessiter d&#39;être des protéines solubles et peuvent être effectuées sur les fractions enrichies ECM &quot;bruts&quot;. D&#39;autres méthodes de décellularisation en utilisant chaotropes (tels que le chlorhydrate de guanidine) d&#39;étudier la composition des ECM par spectrométrie de masse ont been rapporté dans la littérature (revue dans 14) et ont été utilisés en combinaison avec la spectrométrie de masse pour caractériser la composition de l&#39;ECM du cartilage 15,16, coeur 17, glande mammaire 18 et 19 vasculaire et glomérulaire 20 membranes basales. Recommandations méthodes de Décellularisation employant trypsine à digérer sur cellules ne doivent pas être utilisés si ECM sont enrichis pour la protéomique ultérieures analyses, comme la trypsine se traduira par digestion partielle de l&#39;ECM et la perte de protéines et de peptides ECM. De même, si digestion à la collagénase était utilisé pour faciliter une désorganisation du tissu, il serait nécessaire de surveiller attentivement car il provoque ECM digestion et la perte de protéines et de peptides ECM. En contre-solution la digestion dans le gel? protéines de la MEC sont réticulés et fortement insoluble et, même quand on remet en suspension dans du tampon Laemmli 3x (contenant 6% de SDS) et 100 mM de DTT, po séparéorly sur des gels SDS. Ainsi en est-gel digestion pas un procédé préféré. Les applications futures Il est à noter que, bien que non décrit ici, la composition de chacune des fractions intermédiaires recueillies au cours de la décellularisation peut également être analysé par spectrométrie de masse. Cela peut être particulièrement utile lorsque l&#39;on étudie de très petits échantillons (c.-à-biopsies humaines) ou lorsque l&#39;information est demandée sur d&#39;autres fractions cellulaires.

La matrice extracellulaire (ECM) est un maillage complexe de protéines réticulés et glycosylatées qui fournit un soutien architectural et d&#39;ancrage pour les cellules et définit, en partie, des propriétés biomécaniques de tissus 1,2. protéines ECM signalent également les cellules, soit directement à travers leurs récepteurs (par exemple, les intégrines, syndécanes, etc.) ou par une modulation du facteur de croissance de signalisation 3. L&#39;ECM fournit ainsi des signaux biophysiques et biochimiques qui sont d&#39;importants régulateurs de processus cellulaires tels que la prolifération, la survie, la polarisation, la différenciation, la migration, etc. L&#39;ECM joue un rôle clé dans la physiologie, le développement et le vieillissement 4. En outre, plusieurs pathologies, comme les maladies cardio-vasculaires, la fibrose, des maladies musculo-squelettiques, les cancers, sont causés par, ou d&#39;entraîner la modification de l&#39;ECM. En outre, l&#39;ECM contribue au maintien de niches de cellules souches et identifier des molécules d&#39;ECM principaux èmeau soutien stemness aura une application directe dans l&#39;ingénierie tissulaire et la médecine régénérative 5. Cependant, malgré son importance, l&#39;ECM est restée, jusqu&#39;à récemment, peu exploré 6. Analyse in silico a montré que la matrisome, définie comme l&#39;ensemble des ECM et les protéines de l&#39;ECM-associé, comprend les produits de plusieurs centaines de gènes à la fois dans le génome humain et de souris 1,7,8. Cependant, l&#39;insolubilité des protéines de la MEC a entravé la caractérisation systématique de la composition de matrices extracellulaires in vivo des échantillons normaux et pathologiques. Nous avons récemment démontré que cette insolubilité pourrait être mise à profit et être utilisé pour enrichir protéines ECM 8 - 10. Nous et d&#39;autres de plus démontré que la spectrométrie de masse est une méthode de choix pour caractériser la composition d&#39;ECM 8-10, 13. Nousdécrire ici une procédure de décellularisation qui se compose d&#39;incubations séquentielles dans des tampons de pH différents et des concentrations de sel et de détergent. Ce procédé aboutit à l&#39;extraction (ou déplétion) de protéines cytosoliques, nucléaires, la membrane et du cytosquelette et l&#39;enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l&#39;analyse ultérieure par spectrométrie de masse. En utilisant les procédures détaillée et illustrée ici, nous avons réussi à enrichir et caractérisé par spectrométrie de masse des matrices extracellulaires de dix différents tissus et types de tumeurs: poumon normal murin 8, humaine et du côlon murin 8,9, foie humain 9, les tumeurs colorectales humaines et dérivés métastases hépatiques 9, xénogreffes de mélanome 8, xénogreffes tumorales mammaires 10, les îlots pancréatiques murins et murins (Naba insulinomes et al., non publié). Comparaison de l&#39;autre matrisomes révélé signatures ECM Tissue et spécifiques de la tumeur qui pourraient encore être utilisées comme biomarqueurs de diagnostic ou de pronostic potentiels. Nous croyons que cette procédure peut être appliquée à d&#39;autres échantillons avec ou sans modifications relativement mineures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

La matrice extracellulaire (MEC) est un maillage complexe de protéines réticulées qui fournit des indices biophysiques et biochimiques qui sont d&#39;importants régulateurs de la prolifération cellulaire, la survie, la migration, etc. L&#39;ECM joue un rôle important dans le développement et dans diverses pathologies, notamment cardio-vasculaires et des maladies musculo-squelettiques, de la fibrose, et le cancer. Ainsi, la caractérisation de la composition des ECM de tissus normaux et malades pourrait conduire à l&#39;identification de nouveaux biomarqueurs pronostiques et diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Cependant, la nature même de protéines ECM (grandes en taille, réticulés et liés de manière covalente, fortement glycosylée) a rendu des analyses biochimiques de ECM difficile. Pour surmonter ce défi, nous avons développé une méthode pour enrichir ECM à partir de tissus et de tumeurs fraîches ou congelées qui tire parti de l&#39;insolubilité des protéines de la MEC. Nous décrivons ici en détail la procédure de décellularisation qui se compose de i séquentiellencubations dans des tampons de différents pH et des concentrations de sel et de détergent et qui se traduit par une extraction de la) intracellulaire (cytoplasmique, nucléaire, membrane et du cytosquelette) les protéines et 2) l&#39;enrichissement de protéines de la MEC. Nous décrivons ensuite comment deglycosylate et digérer préparations de protéines ECM enrichie en peptides pour l&#39;analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

Contrôle de la qualité de la procédure de décellularisation L&#39;efficacité de la décellularisation peut être surveillée par l&#39;analyse de la teneur en protéine de chaque fraction par western blot. Le tableau 2 donne la liste des protéines d&#39;intérêt diagnostique pour évaluer la qualité de la procédure de décellularisation. La figure 2A montre l&#39;extraction efficace dans les fractions intermédiaires de cytosolique (GAPDH ), histones nucléaires (), la membrane (β1 intégrine) et du cytosquelette (actine) des protéines, tandis que les pas de protéines d&#39;ECM (collagène I) est détectée dans ces fractions (Figure 2). À son tour, le culot final est enrichie en protéines de la MEC et largement appauvri en protéines intracellulaires (figure 2A). La figure 2B présente satisfaisant épuisement de la protéine intracellulaire (pas d&#39;histone est détecté dans la fraction de l&#39;ECM riche), bien que, l&#39;actine peut encore être détecté dans la fraction de l&#39;ECM riches et l&#39;appauvrissement de monomère collagène I- Poids moléculaire apparent ~ 110 kDa, correspondant présumée au collagène démonté I - peut être observée dans la fraction CS. Nous aussi surveiller régulièrement protéines ECM supplémentaires tels que la fibronectine et la laminine, bien que, dans certains tissus ces composants peuvent être partiellement solubilisés dans les fractions 8 à 10 précédentes. Par exemple, la fibronectine se produit également de la fibronectine plasmatique soluble qui ne sont pas incorporés dans l&#39;ECM. La perfusion du tissu avant l&#39;extraction réduit la concentration de fibronectine plasmatique mais toujours ne l&#39;élimine pas. Dans certains tissus, les laminines sont trouvés lâchement associés à la surface cellulaire ou l&#39;ECM et extrait dans les fractions intermédiaires. Si cela se produit, il peut être résolu en modifiant les conditions d&#39;extraction (voir la discussion). Notez que l&#39;enrichissement de protéines de la MEC et l&#39;épuisement concomitant de composants intracellulaires sont basées sur le rapport de la solubilité des protéines dans les différents tampons. Thest diffère entre les différents tissus - dans certains cas, les histones et actine sont plus facilement extraits que dans d&#39;autres. Notons aussi que, bien que les histones sont censés être extrait dans la fraction N (figure 2B), on observe souvent un épuisement plus complet des histones dans la M ou fraction CS (Figure 2A et B). Concentration de peptide indicatif prévu La concentration de la solution de peptide obtenu après digestion, de l&#39;acidification et de dessalage peut être mesurée par spectrophotométrie, soit par mesure de l&#39;absorbance de la solution de peptide en utilisant la longueur d&#39;onde de 280 nm correspondant à la tryptophane, la tyrosine, ou en utilisant la longueur d&#39;onde de 205 nm correspondant à l&#39;absorbance du peptide obligations. Nous avons mesuré la concentration des solutions de peptides obtenus à partir de la décellularisation de trois échantillons poumons murins (82 mg, 100 mg et 100 mg, respectivement) préparouge en parallèle et obtenu de chaque: 424 ng / ul, 450 ng / ul et 580 ng / ul de peptides respectivement. Identification des peptides ECM par spectrométrie de masse Analyse par spectrométrie de masse de la composition d&#39;échantillons de protéines ECM enrichi, préparés comme décrit ici, a montré que&gt; 70% de l&#39;intensité de signal correspond à ECM et protéines ECM associé à 10/08. Tableau 1. Volume de réactifs de kit compartimentés Extraction à decellularize 100 mg (poids humide) de tissu ou une tumeur. Ce tableau présente la composition et le volume de chaque tampon utilisé pour mener l&#39;décellularisation de 100 mg de tissu ou une tumeur. Un cocktail d&#39;inhibiteurs de proteases est fourni en solution 50x et doit être ajouté à chaque tampon 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Réactifs de kit d&#39;extraction de protéines Compartiment </td><td> Volume pour 100 mg de tissu </td><td> Composition (basé sur Millipore Fiche chat # 2145 1) </td></tr><tr><td> Tampon C </td><td> 500 ul </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, HAE 4, sucrose, glycérol, orthovanadate de sodium 5 </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l&#39;EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> Buffer N </td><td> 2 x 150 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, le glycerol, orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l&#39;EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> Tampon M </td><td> 100 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycérol, le désoxycholate de sodium (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> Buffer CS </td><td> 200 ul </td><td> PIPES (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, le saccharose, dodécylsulfate de sodium (SDS) 7, orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> Tampon C </td><td> 150 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, l&#39;EDTA, le saccharose, le glycerol, orthovanadate de sodium </td></tr><tr><td> PBS 1x </td><td> 500 pi / lavage </td><td> - </td></tr></tbody></table> Notes: 1 Pour des raisons de propriété, nous avons été incapables d&#39;obtenir la composition précise des tampons du fournisseur du kit, mais nous incluons ici quelques notes sur la base de notre propre expérience en utilisant des tampons faits maison pour effectuer des extractions similaires. Inhibiteur de la protéase 2: il est souhaitable d&#39;inclure une variété d&#39;inhibiteurs contre la cystéine, la sérine et la thréonine peptidases, des estérases à sérine, les métalloprotéinases dépendantes des cations divalents etc.De nombreux cocktails disponibles dans le commerce des inhibiteurs de protéase existent. 3 pH supérieur à 7,0 est un inhibiteur efficace de proteases lysosomales. 4 EDTA (généralement utilisé à 2 mM) est un inhibiteur efficace de protéases dépendant des cations divalents. 5 orthovanadate de sodium est un inhibiteur de la phosphatase. Une concentration typique efficace serait 0,5-5 mM. 6 NP40 à 0,1% -0,5% est suffisante pour solubiliser les lipides membranaires plus. La combinaison de NP40 et DOC - souvent utilisé à des concentrations égales (par exemple, 0,5% de chaque) - est souvent utilisé comme une extraction plus strictes qui laisse encore de nombreuses interactions protéine-protéine intacte. 7 SDS est un détergent ionique plus strictes (CMC 0,1%). Il peut également être utilisé en combinaison avec les deux autres détergents SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% en tant que tampon de stringence intermédiaire. Tableau 2. Les protéines de diagnostic àsurveiller la qualité de la procédure de décellularisation. Ce tableau donne des exemples de protéines qui sont caractéristiques de chaque compartiment subcellulaire (cytosol, le noyau, membrane plasmique, cytosquelette et ECM) qui peut être utilisé pour surveiller la qualité de la procédure de décellularisation et l&#39;efficacité de la ECM-enrichissement. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Intracellulaire Compartiment </td><td> Protéines de diagnostic </td></tr><tr><td> Protéines cytosoliques </td><td> La glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) </td></tr><tr><td> Des protéines nucléaires </td><td> Histones, lamines, nucléoporine </td></tr><tr><td> Les protéines membranaires </td><td> Les intégrines, de récepteur de la transferrine </td></tr><tr><td> Protéines du cytosquelette </td><td> Actine, tubuline, Vimentin </td></tr><tr><td> protéines ECM de la membrane basale </td><td> Le collagène IV, Nidogens, laminines </td></tr><tr><td> Protéines ECM interstitiels (interstitielles) </td><td> Collagène I, collagène III, collagène VI, fibronectine </td></tr></tbody></table> Pour la recommandation sur les anticorps, consultez nos publications 8-10. Tableau 3. Volume de réactifs pour digérer les échantillons ECM enrichi en peptides. Ce tableau répertorie les réactifs utilisés pour remettre en suspension les échantillons de protéines ECM enrichi et de réduire, alkylation, deglycosylate et de digérer les échantillons de protéines en peptides avant l&#39;analyse par spectrométrie de masse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Préparation </td><td> Concentration finale / Montant pour pastille 1 mm d&#39;épaisseur (~ 5-10 mg de poids sec) </td><td> Volume pour pastille 1 mm d&#39;épaisseur (~ 5-10 mg de poids sec) </td></tr><tr><td> du bicarbonate d&#39;ammonium (NH 4 HCO 3) </td><td> Solution 100 mM dans de l&#39;eau de qualité HPLC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Urée </td><td> Solution 8 M en mM de bicarbonate d&#39;ammonium 100 </td><td> 8 M </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> Reconstituer dans l&#39;eau de qualité HPLC à 500 mM </td><td> 10 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> Reconstituer dans l&#39;eau de qualité HPLC à 500 mM </td><td> 25 mM </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Peptide N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> Solution commerciale à 500 U / pl </td><td> 1000 U </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Endoprotéinase LysC, spectrométrie de masse de qualité </td><td> Reconstituer dans l&#39;eau de qualité HPLC à 0,5 pg / pl </td><td> 1 pg </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Trypsine, la spectrométrie de masse de qualité (1 tour) </td><td> Solution commerciale à 0,5 pg / pl </td><td> 3 pg </td><td> 6 pi </td></tr><tr><td> Trypsine, la spectrométrie de masse de qualité (phase 2) </td><td> Solution commerciale à 0,5 pg / pl </td><td> 1,5 pg </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoro-acétique (TFA) </td><td> Solution à 50% dans de l&#39;eau de qualité CLHP </td><td> - </td><td> 2-5 pi </td></tr><tr><td> L&#39;acétonitrile (élution) </td><td> Solution à 60% avec 0,1% de TFA dans de l&#39;eau de qualité CLHP </td><td> - </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> L&#39;acétonitrile (reconstitution) </td><td> Solution à 3% avec 0,1% de TFA dans de l&#39;eau de qualité CLHP </td><td> - </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. Schéma de la procédure expérimentale. De workflow schématique du Protocol à decellularize tissus (Section 1), le contrôle de la qualité de la décellularisation et évaluer l&#39;enrichissement de l&#39;ECM (Section 2) et à digérer les échantillons de protéines ECM enrichi en peptides avant l&#39;analyse par spectrométrie de masse (section 3). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Contrôle de la qualité de la procédure de décellularisation par western blot Western blots ont été effectués sur poumon de souris (A) et mammaire humain carcinome xénogreffe (B) des échantillons en utilisant les anticorps suivants:. Lapin anti-actine (clone 14-1) et de lapin anti -β1 intégrine anticorps produits dans notre laboratoire; lapin anti-collagène I, souris anti-GAPDH et les anticorps de lapin anti-pan-histones étaient de Millipore. Après l&#39;incubation de l&#39;anticorps primaire, les membranes ont été lavées et incubées en présence de chèvre anti-lapin conjugué à HRP ou de chèvre anti-mouse anticorps secondaire de Jackson Immuno Research Laboratory. Enfin, les membranes ont été lavées et incubées dans chimioluminescence Western foudre ™ Reagent (PerkinElmer LAS). * Indique une contamination résiduelle minimale d&#39;histone de la fraction riche en ECM. ** Indique l&#39;épuisement partiel du monomère (présumée non monté) collagène I dans la fraction CS. *** Indique une contamination de l&#39;actine résiduel de la fraction riche en ECM. Le frottis détecté avec l&#39;anticorps anti-collagène représente différents niveaux de modifications post-traductionnelles (par exemple, la réticulation, glycosylation).

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Research

JoVE Journal

Biology

26.6K vues.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pression atmosphérique imagerie moléculaire des tissus biologiques et biofilms par spectrométrie de masse LAESI

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rapide, méthode évolutive pour l&#39;isolement, l&#39;étude fonctionnelle, et l&#39;analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Préparation des échantillons pour l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse des microvaisseaux oculaires

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...