Les auteurs remercient les membres du groupe de Sharon pour leur examen critique, et pour leur contribution au manuscrit. Nous sommes reconnaissants de l&#39;appui des programmes et des Morasha Bikura, l&#39;Israel Science Foundation (Grant 378/08 et n ° 1823-1807), Josef Cohn Minerva Centre de recherche biomembrane, la famille Chais Fellows Program pour les nouveaux chercheurs, l&#39;Abraham et Sonia Rochlin Fondation Trust Wolfson famille de bienfaisance, le Helen et Milton A. Kimmelman Center for Structure biomoléculaire et de l&#39;Assemblée; la succession de Shlomo et Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, et Karen Siem, Royaume-Uni. Nous sommes reconnaissants à Dan Tawfik et Itamar Yadid de nous donner l&#39;exemple de variante de la lectine.

Partie 1: Préparation d&#39;or enrobées de capillaires pour électronébulisation nanodébit Analyse des complexes non covalents est généralement effectuée au moyen d&#39;ionisation électrospray nanodébit (NESI) 6, utilisant le verre ou le quartz capillaires qui ont été tiré à une pointe fine (diamètre ~ 1 um interne), et revêtues d&#39;un matériau conducteur (généralement en or) . Ces capillaires sont disponibles prêtes à l&#39;utilisation de sources commerciales (nouvel objectif ou Proxeon); cependant, il peut être plus rentable pour les préparer en interne: <ol><li> Aide de deux bandes d&#39;un tampon adhésif double-face pour le fond d&#39;une boîte de Pétri, 2 cm de distance. Placez une baguette de verre (8 cm x 5 mm) dans le centre de l&#39;un des pads. Le tampon adhésif tiendra les capillaires en place, et la tige de verre soutiendra le prêt capillaires, et gardez les conseils de rupture (Fig. 1). </li><li> Utilisez capillaires en verre borosilicate, 1,0 mm x 0,78 mm di OD (nous utilisons des paquets de 500 capillaires minces parois de borosilicate de Warner Instruments, cat. Aucune. G100TF-4). Insérer un capillaire dans l&#39;extracteur d&#39;aiguilles (nous utilisons le modèle P-97 de la Cie Sutter Instrument). Pince capillaire délicatement en place, et d&#39;ajuster sa position afin qu&#39;elle se trouve dans le centre de filament chauffant l&#39;aiguille extracteur. Serrer les colliers doucement, jusqu&#39;à ce que le capillaire est tenu ferme aux deux extrémités. </li><li> Tirez le capillaire, en utilisant un programme prédéfini. Chaque capillaire tiré donnera lieu à deux finales, en forme de capillaires. Le processus de programmation de l&#39;extracteur est l&#39;un des essais-erreurs, jusqu&#39;à une forme de la pointe acceptable est obtenue. Nous utilisons le programme suivant: <table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Chaleur </td><td> Tirez </td><td> Vell </td><td> Temps </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Retirez les capillaires tiré de l&#39;instrument et d&#39;inspecter les conseils, en écartant celles qui sont déformées ou cassées. Utilisez une pince à épiler contondants (nous utilisons une pince à épiler de précision de positionnement de CK), de placer les capillaires dans la boîte de Pétri. La base de la capillarité doit être joint à la bande adhésive et la partie supérieure doit s&#39;appuyer sur la tige de verre, avec la pointe dirigée vers le haut. </li><li> Une fois la boîte de Pétri est pleine (environ 80 capillaires dans un ajustement de 10 cm de diamètre vaisselle), insérez la plaque dans l&#39;or par pulvérisation coucheuse (nous utilisons le modèle non. EMS550, d&#39;EMS). Assurez-vous que l&#39;alimentation en gaz est choisi selon les instructions du fabricant, et d&#39;activer un cycle de revêtement prédéfinies (on utilise la pression d&#39;Argon 4 psi, à une pression à vide de 5 x 10 -2 mbar, un courant de 45mA, et un temps de revêtement de 1 min, pour les 3-6 cycles, jusqu&#39;à ce que les capillaires sont uniformément dorés). </li></ol> Partie 2: Préparation des échantillons <ol><li> Faibles concentrations micromolaires de l&#39;échantillon sont nécessaires (1 - 20 uM). Si nécessaire, concentrer l&#39;échantillon en utilisant des dispositifs d&#39;ultrafiltration centrifuge (par exemple, Vivaspin de Sartorius, ou Nanosep de Pall Corporation). Il est recommandé de vérifier l&#39;adsorption du complexe protéique de la membrane périphérique, avant de l&#39;utiliser. </li><li> Souvent, les tampons de purification ou de solutions de stockage du complexe protéique sont pas compatibles avec Nesi, pour lesquels seules des solutions volatiles peuvent être utilisés. Par conséquent, l&#39;échange de tampon est nécessaire. Cette étape cruciale, dans laquelle toutes les traces de sels, les molécules de tampon ou de tout autre non-volatile adduits tels que la glycérine, la TNT, ou de l&#39;EDTA sont enlevés, qui détermine la qualité des spectres. Habituellement, une solution aqueuse d&#39;acétate d&#39;ammonium est utilisé à une concentration comprise entre 5 mm et 1 M, et le pH à 6-8. Tampon d&#39;échange peut être effectué en utilisant une colonne de filtration sur gel microcentrifugeuse (par exemple, Micro Bio-Spin 6 colonnes de chromatographie, de Bio-Rad). Cette étape peut être répétée 1-3 fois avec une dilution minimale (moins d&#39;un facteur de 1,3 par dispositif 5), jusqu&#39;à l&#39;échange maximal est atteint. Si la concentration et l&#39;échange de tampon sont requises, elles peuvent faire ensemble, en utilisant l&#39;ultrafiltration centrifuge (e, g., Vivaspin de Sartorius, ou Nanosep de Pall Corporation). </li></ol> Partie 3: Etalonnage du spectromètre de masse pour des mesures de masse à haute La plupart des expériences menées sur complexes multi-protéiques sont réalisées en utilisant une électronébulisation nano-quadripolaire à temps de vol (Q-TOF) instrument. Il est suggéré que vous utilisez un filtre de masse quadripolaire ajusté pour les basses fréquences, afin de permettre la transmission et l&#39;analyse de masse d&#39;ions à haute valeurs m / z 7,8. Il estégalement recommandé que les entrées de gaz ou de 7,8 manches 9 soit ajouté à l&#39;instrument dans le guide d&#39;ions d&#39;abord, pour permettre le contrôle de pression à l&#39;étape du premier aspirateur. Ce dernier permet d&#39;optimiser la transmission et désolvatation des ions très grandes 7-9. Actuellement, commercial ESI-TOF et Q-ToF instruments sont disponibles auprès de plusieurs fabricants (par exemple, les eaux, SCIEX, Bruker, ou Agilent) qui peut être modifié relativement facilement et à moindre coût, pour les applications MS natif 7,8. Il est possible, cependant, d&#39;utiliser les configurations standard ToF ou QToF sur des instruments tels que LCT ou QToF1 (Waters) d&#39;acquérir des spectres de masse pour des complexes jusqu&#39;à 1 MDa, sans avoir besoin de 5 modifications matérielles. Le protocole décrit ci-dessous a été réalisée sur un instrument Synapt (Waters). <ol><li> Préparer 100 mg / ml solution de CsI dans l&#39;eau purifiée. CSI est utilisé pour l&#39;étalonnage de masse élevée que les amas de sel une seule charge, (Csl) n Cs + s&#39;étendre sur une gamme de masse de large, de 393 m / z à plus de 10 000 (fig. 2). </li><li> En utilisant une pince à épiler émoussé, prenez un capillaire revêtu de la boîte de Pétri et 2μL la charge de la solution de CsI dans le capillaire, en utilisant une astuce GeLoader Eppendorf. </li><li> Insérez le tube capillaire dans le porte-capillaire, et ajuster le capillaire de telle manière que la pointe est d&#39;environ 10 mm du bord de la titulaire. </li><li> Glissez la solution vers l&#39;extrémité du capillaire soit manuellement, soit en utilisant un adaptateur de spin down. </li><li> Placer le capillaire sous un microscope optique et de l&#39;assiette de la pointe, en utilisant la forte de type AA pincettes. </li><li> Connectez le support capillaire à l&#39;interface ES nanodébit. Tournez la scène xyz vers l&#39;arrière pour éviter d&#39;endommager le capillaire, et pousser la scène dans sa position activée. Le capillaire doit être placé 1 - 10 mm de l&#39;orifice du cône. </li><li> Appliquer la tension capillaire (1050-1400 V) et la pression nanodébit faible (0.00 à 0,03 bar) jusqu&#39;à ce spray est lancé, puis essayez de réduire la pression nanodébit à une valeur minimale. </li><li> Optimiser l&#39;intensité du signal en ajustant la position de l&#39;étape de XYZ, la tension capillaire, la pression nanodébit, et le débit de gaz de désolvatation. </li><li> Pour détecter une large gamme de masse du Csl pic de série, les tensions accélération doit être optimisé (nous utilisons les paramètres suivants: 1.3 à 1.7 kV capillaires, cône échantillon de 80-150V, l&#39;extraction cône 1-3 V). </li><li> Afin d&#39;optimiser la transmission des ions de masse élevée, qui nécessitent des conditions de désolvatation doux, la pression soutien dans la phase initiale de vide, entre la source et l&#39;analyseur, doit être soulevée. Ceci peut être réalisé en prenant soin de réduire la conductance de la ligne de source de vide à la pompe à défiler, en fermant partiellement la vanne d&#39;isolement (SpeediValve). Afin de définir le point optimal, ce dernier devrait être fait tout en surveillant l&#39;effet sur l&#39;intensité du signal (nous utilisons habituellement de 3,0 à 6,5 mbar). </li><li> Recueillir environ 30 balayages à une scans / seconde, à une gamme de m / z compris entre 1.000 à 15.000 m / z. </li><li> Après l&#39;acquisition, de calibrer le TOF utilisant la table d&#39;étalonnage appropriée. </li></ol> Partie 4: analyse des MS de complexes protéiques intacts <ol><li> Chargez votre échantillon, tel que décrit (Partie 3, articles 2-5), et d&#39;initier de pulvérisation. </li><li> Commencez par l&#39;optimisation initiale de la pulvérisation (Partie 3, articles 6-9), jusqu&#39;à ce que le signal est détecté. La position exacte des états de charge est une protéine dépendante, mais elle peut être prédit, en utilisant la relation entre la masse d&#39;ions et de l&#39;état de charge moyenne, ainsi: (Z AV) 10: Z = 0,0778 √ AV (m), dans laquelle m est la masse du complexe en Daltons. Pour empêcher la dissociation complexes, ne chauffez pas la source d&#39;ions: soit passer le radiateur, ou maintenir la température inférieure à 40 ° C. </li><li> Variez la position capillaire, cône de l&#39;échantillon et les tensions d&#39;extraction pour maximiser la transmission d&#39;ions, et vérifier le changement résultant dans les spectres. Un point de départ possible pourrait être cônes de tension de 100 V; extracteur de cône: 1 V, tension capillaire 1,5 kV. D&#39;optimiser ces paramètres, en combinaison avec la pression nanodébit. </li><li> Afin d&#39;améliorer la désolvatation et la bande hors de l&#39;eau résiduelle et les composants de tampon, d&#39;augmenter la tension de polarisation et de la pression du gaz dans la cellule de collision. Cette étape doit être effectuée avec soin, pour empêcher la dissociation du complexe. Tensions de polarisation typiques sont dans la fourchette de 10-100 V, avec un débit de gaz piège de 1-10 ml / min (Fig. 3). Réglage manuel de la mise en RF et le profil quadripôle peut améliorer la transmission des ions de masse élevée. </li><li> Ajustez Trap et énergies de collision de transfert. Souvent, des tensions plus élevées sont nécessaires pour la transmission des ions de masse élevée (habituellement dans la gamme de 10-30 V). À ce stade, il est important d&#39;éviter une collision provoquée par la dissociation du complexe. </li><li> Après un signal stable est reached, il est recommandé que la pression et la tension capillaire nanodébit être réduite à des valeurs minimales, tout en conservant de pulvérisation stable. </li></ol> Partie 5: spectrométrie de masse en tandem: dissocier les complexes protéiques <ol><li> Une fois un signal optimal et stable a été obtenue, sélectionnez un ion précurseur. Placer le centre de masse et la largeur d&#39;isolement (nous utilisons généralement une résolution de 12 LM, et une résolution HM entre 13 et 15). Utiliser une gamme de masse large pour détecter la masse élevée / faible charge de produits de dissociation. Il est recommandé de définir la gamme de m / z pour le niveau maximum, puis de le réduire à la valeur désirée. Nous suggérons en outre de superposer la MS et MS / MS spectres, pour valider l&#39;isolement de l&#39;ion précurseur choisi. </li><li> Pour effectuer MS / MS, dissocier l&#39;ion précurseur en augmentant l&#39;énergie de collision (CE) et la pression sur la cellule de collision. Augmenter ou Piège ou de transfert CE progressivement, par paliers de 10-20V, et d&#39;élever la pression du gaz de collision à 0-5 ml / min (valeurs communes). Surveiller les changements dans les spectres que les conditions optimales d&#39;activation est atteint. Énergie d&#39;activation élevée peut provoquer la dissociation d&#39;un ou plusieurs sous-unités du complexe intact, et de clarifier les affinités d&#39;interaction des différentes sous-unités. Nous utilisons généralement de l&#39;argon comme gaz de collision dans les cellules piège / de transfert, bien que les avantages d&#39;utiliser un plus lourd de gaz (par exemple, Xe ou SF 6) ont été rapportés, cependant, ces gaz sont nettement plus coûteux 11 (Fig. 3). </li><li> Il est recommandé que plus d&#39;un état de charge sera sélectionnée pour MS / MS. Dans le cas de composants qui se chevauchent, l&#39;acquisition d&#39;un ensemble de spectres MS tandem va aider à résoudre la série de charge des différentes populations. Par ailleurs, des états de charge plus élevée va se dissocier plus facilement, par rapport à des états de charge inférieure 12. </li><li> En plus de la caractérisation du complexe intact, il est suggéré que les petits sous-complexes en solution sera généré, sous conditions dénaturantes douces. Les analyses MS et MS / MS de sous-complexes forment la base pour définir l&#39;architecture sous-unité du complexe de 13. Pour rupture partielle de la sous-unité-unité des interactions, ajouter graduellement des solvants organiques (méthanol par exemple, l&#39;isopropanol, ou l&#39;acétonitrile) à une concentration de 50%, ou de changer le pH de la solution par addition d&#39;ammoniaque ou d&#39;acide formique (jusqu&#39;à une concentration de 4 %). </li><li> Afin de déterminer les masses des unités individuelles qui composent le complexe, il est important d&#39;acquérir un spectre dans des conditions dénaturantes. Ceci peut être réalisé en utilisant Zip-Tip C 4 (Millipore) avec un 25/75 d&#39;eau / acétonitrile ratio, avec l&#39;acide formique 1% comme solvant d&#39;élution. </li></ol> Partie 6: traitement et analyse des données <ol><li> Les données sont analysées hors ligne, en utilisant une analyse spectrale des programmes pour MS spectres. Nous utilisons normalement le programme MassLynx (Waters). </li><li> Pour les spectres qui couvrent une large gamme de m / z gamme, nous recommandons que différents régimes de lissage et de paramètres centroïde être appliquées pour la haute et basse de m / z régions, afin de refléter la différence de résolution de pointe de ces régions. </li><li> Pour identifier les séries de charge et de calculer des états de charge et des masses, le «manuel trouver&quot; fonction de MassLynx peut être appliquée. Dans le cas des spectres de masse avec des composants complexes qui se chevauchent, le calcul manuel des masses peut être plus facile. </li><li> Pour faciliter ces processus d&#39;affectation, des logiciels supplémentaires peuvent être utilisés, par exemple: pour la déconvolution des spectres MaxEnt 14, pour le montage de pointe SOMMS et simulation 15, et d&#39;assigner SOMMET la composition et la stoechiométrie des sous-complexes de protéines et de générer des réseaux d&#39;interactions protéiques 13,16,17 . </li></ol> Partie 7: Résultats Représentant <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Préparation recouvert d&#39;or nano-electrospray capillaires. A. Fixez les deux bandes adhésives double face à une boîte de Pétri, 2 cm de distance. Pour soutenir le prêt capillaires, placer une tige de verre (8 cm x 5 mm) dans le centre de l&#39;un des pads. B. bâton l&#39;extrémité émoussée de l&#39;préparées capillaires de la bande adhésive, et penchez la pointe sur la tige de verre. C. Une fois la boîte de Pétri est rempli avec le prêt capillaires, les enduire avec de l&#39;or jusqu&#39;à ce qu&#39;une fine pellicule d&#39;or est uniformément déposée sur la surface externe des capillaires. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Étalonnage de masse haute en utilisant des ions iodure de césium. Les grandes grappes et monisotopic du Csl ont fait le choix de composé de l&#39;étalonnage des spectromètres de masse pour l&#39;analyse de la grand&#39;messe. La série de pics équidistants s&#39;étendent sur ​​une large gamme, de m / z 393 à plus de 10.000. Ils sont assignatslable à une seule charge les clusters sel de la composition générale (Csl) n Cs +. Signaux supplémentaires entre les pics majeurs sont causés par les espèces à double et triple charge de la série; [(CsI) n Cs2] 2 + et [(CsI) n Cs3] 3 +, respectivement. Augmenter la pression à l&#39;étape initiale de vide est essentielle pour détecter les grappes de masse élevée. L&#39;effet de la pression sur les pics de masse élevée est démontrée dans Panneaux A. et B. avec des relectures de pression de 1,2 et 5,3, respectivement. C. Extension du spectre de masse montre à B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Spectres de masse electrospray nanodébit d&#39;une lectine pentamérique. A. La spectrométrie de masse d&#39;un complexe lectine variante (dérivé de LIB1-B7 par évolution dirigée 18) donne lieu à un état ​​de charge distributions entre 3.000 et 5.000 m / z; cependant, en raison de l&#39;insuffisance désolvatation des ions, les pics sont larges. Comparaison du panneau A. et B. montrent l&#39;effet d&#39;augmenter la tension de polarisation de 4V (A). À 15V (B.) Sur la largeur du pic. Cette augmentation dans des conditions de l&#39;accélération provoque le décapage de l&#39;eau résiduelle et les composants mémoire tampon, ce qui donne un spectre à haute résolution. La masse mesurée (60 240 ± 38 Da) correspond à un complexe pentamérique. C. L&#39;état de charge 15 a ensuite été sélectionné pour le tandem MS analyse (en gris dans le groupe B). D. L&#39;augmentation de l&#39;énergie de collision provoque la libération d&#39;un monomère très chargé, centré à 1664 m / z, et un complexe tétramérique dépouillé, dans la gamme des 5000 - 8000 m / z. Tous les spectres ont été obtenus à partir d&#39;un échantillon contenant 20 uM de solution dans l&#39;acétate d&#39;ammonium 0.5M.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Pour acquérir la qualité de haute attention de spectres devrait être donnée à des étapes de préparation d&#39;échantillons, qui incluent la concentration de l&#39;échantillon et l&#39;échange de tampon. Plus les échantillons dilués donnera un signal faible, tandis que les échantillons très concentrés peuvent être assez visqueux, et de bloquer l&#39;aiguille d&#39;électronébulisation. Par ailleurs, des additifs tels que les sels solution de glycérol, les détergents, les ions métalliques, et des agents réducteurs (TNT ou β-mercaptoéthanol), ont tendance à adhérer à la surface externe des protéines, et provoquer un élargissement des pics. Par conséquent, afin d&#39;atteindre des pics bien résolu, ces éléments devraient être ajoutés à la plus faible concentration possible. Un autre paramètre clé est la position de la nanodébit capillaire, par rapport à l&#39;orifice du spectromètre de masse. Trouver le &quot;sweet spot&quot; pourrait être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés, et pourtant, elle influence considérablement la qualité des spectres. Il est également important d&#39;examiner les nanodébit capillaires avant le début de la pulvérisation. La taille des gouttelettes est une fonction du diamètre pointe, qui devrait être ~ 1 um. De petites gouttelettes conduire à ionisation plus efficace, et serait donc avantageux. Il est également important de valider qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles d&#39;air dans le capillaire qui pourrait bloquer l&#39;écoulement, et que le revêtement d&#39;or n&#39;est pas dépouillé du capillaire lors de l&#39;acquisition, si oui, encore couper la pointe. Gardez à l&#39;esprit qu&#39;une quantité excessive de l&#39;échantillon sera d&#39;accroître la possibilité d&#39;optimiser les conditions de MS tels que la tension capillaire, tensions d&#39;accélération, la pression et l&#39;énergie de collision. Globalement, les procédures expliquées dans le protocole ont été utilisées pour déterminer la composition, la stoechiométrie et l&#39;architecture des complexes protéiques de nombreux (voir avis 2,3,4). Analyse des complexes MDa grande envergure comme le ribosome et 19 capsides de virus hautement ordonné 20-22, dans la définition de liaison du substrat à des machines moléculaires 23-25, ou la caractérisation des réseaux d&#39;interactions sous-unité 26,17,16,17,27,28 servir mais quelques exemples de la valeur de cette approche.

Exigences de l&#39;échantillon: <table border="1"><tr><td> Exemple </td><td> Exigence </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 uL </td><td> Par capillarité </td></tr><tr><td> Concentration </td><td> 1-20μM </td><td> Par complexe </td></tr><tr><td> Tampon </td><td> Aquanos tampons volatils tels que l&#39;acétate d&#39;ammonium à pH = 6-8 </td><td> Typiquement 5 mm-1M </td></tr><tr><td> Détergent </td><td> Minimes </td><td> Des grappes de molécules détergentes produisent des pics larges et non résolues </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Minimal (jusqu&#39;à 5%) </td><td> Adhère non spécifique aux protéines et, par conséquent, des pics larges sont observées </td></tr><tr><td> Les solvants organiques </td><td> Jusqu&#39;à 50% </td><td> Pourrait dénaturer les protéines complexes </td></tr><tr><td> Acides </td><td> Jusqu&#39;à 4% </td><td> Complexes protéiques Dénaturer </td></tr><tr><td> Sels </td><td> Minimes </td><td> Adduits Sel conduire à des pics larges et non résolues </td></tr><tr><td> TNT </td><td> Minimes </td><td> UM 1-2 peut être présente </td></tr><tr><td> Les agents chélateurs </td><td> Minimes </td><td> Dessus de 250 uM conduire à la formation d&#39;adduits vaste </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Les cellules vivantes contrôler et réguler leurs processus biologiques à travers l&#39;action coordonnée d&#39;un grand nombre de protéines qui s&#39;assemblent en un tableau de dynamique, complexes multi-protéiques 1. Pour acquérir une compréhension mécaniste de divers processus cellulaires, il est crucial de déterminer la structure des complexes protéiques tels, et de révéler comment leur organisation structurelle dicte leur fonction. De nombreux aspects de complexes multi-protéiques sont, cependant, difficile à caractériser, en raison de leur nature hétérogène, la structure asymétrique et dynamique. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour l&#39;étude des niveaux de l&#39;enseignement supérieur de l&#39;organisation des protéines. Un des outils émergents pour l&#39;analyse de la biologie structurale des complexes macromoléculaires est la spectrométrie de masse (MS) 2-5. Cette méthode donne des informations sur la composition des protéines complexes, stoechiométrie sous-unité, et la topologie structurelle. La puissance de MS vient de sa grande sensibilité et, en conséquence, l&#39;exigence de l&#39;échantillon, ce qui permet l&#39;examen des complexes de protéines exprimées à des niveaux endogènes. Un autre avantage est la vitesse d&#39;analyse, qui permet le suivi des réactions en temps réel. Par ailleurs, la technique peut mesurer simultanément les caractéristiques des populations distinctes qui coexistent dans un mélange. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l&#39;application des réformes structurelles MS pour l&#39;analyse des assemblages de protéines. La procédure commence par la préparation de l&#39;or à revêtement capillaires pour l&#39;ionisation electrospray nanodébit (NESI). Il continue ensuite avec la préparation des échantillons, en insistant sur les conditions de tampon qui doit être compatible avec NESI d&#39;une part, et permettre de maintenir intactes les complexes de l&#39;autre. Nous expliquerons ensuite, étape par étape, comment optimiser les conditions expérimentales pour des mesures de masse à haute et à acquérir MS et MS tandem spectres. Enfin, nous traçons le traitement des données et des analyses qui suivent. Plutôt que de tenter de caractériser tous les aspects des assemblages de protéines, ce protocole introduit les procédures de base MS, permettant des performances d&#39;expériences MS et MS / MS sur de complexes non covalents. Globalement, notre objectif est de fournir aux chercheurs connaissent pas le domaine de la structure MS, avec une connaissance des principaux outils expérimentaux.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

La spectrométrie de masse s&#39;est avérée être un outil précieux pour l&#39;analyse des complexes protéiques importants. Cette méthode permet un aperçu de l&#39;architecture composition, la stoechiométrie et générale de la multi-unité assemblées. Ici, nous décrivons, étape par étape, comment réaliser une analyse par spectrométrie de masse structurel, et de caractériser des structures macromoléculaires.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

24.0K vues.  Weizmann Institute of Science. La spectrométrie de masse s'est avérée être un outil précieux pour l'analyse des complexes protéiques importants. Cette méthode permet un aperçu de l'architecture composition, la stoechiométrie et générale de la multi-unité assemblées. Ici, nous décrivons, étape par étape, comment réaliser une analyse par spectrométrie de masse structurel, et de caractériser des structures macromoléculaires.

Vidéo: Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pression atmosphérique imagerie moléculaire des tissus biologiques et biofilms par spectrométrie de masse LAESI

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analyse directe des cellules isolées par spectrométrie de masse à la pression atmosphérique

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative