Les auteurs sont reconnaissants à H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, et G. Yap pour des discussions fructueuses et des réactifs. Nous sommes reconnaissants à J. Dausman, R. Flannery, et J. Jackson pour l&#39;aide à la gestion de la colonie de souris. Nous sommes reconnaissants à P. Wisniewski pour FACSorting. EMF a été soutenu par le Programme scientifique sur la frontière de l&#39;homme. RJ a été soutenue par l&#39;Institut national de bourses en santé RO1-HD045022 et R37-CA084198. HLP a été soutenue par des subventions du National Institute of Health.

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolement des cellules du donneur Avant de T spécifiques ou des cellules B peuvent être utilisés comme les cellules du donneur de générer des modèles de souris Transnuclear, les souris doivent être infecté par un pathogène d&#39;intérêt ou immunisées avec un antigène d&#39;intérêt. Puisque nous avons utilisé les cellules CD8 + spécifiques pour Toxoplasma gondii, le protocole suivant décrira la génération et l&#39;isolement de ces cellules et doit être adaptée en fonction de l&#39;intérêt personnel. <ol><li> Les kystes provenant d&#39;un homogénat de cerveau de souris (environ 40) sont injectés par voie intrapéritonéale en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) des souris, qui permet l&#39;isolement de deux H-2 b et H-2 d restreint cellules T CD8 +. </li><li> Au pic de la réponse immunitaire, la souris infectées est euthanasié, la rate isolés et placés dans un plat contenant 6 cellules ml de sang rouges (RBC) du tampon de lyse. </li><li> En utilisant les côtés givrés de deux diapositives de couverture, la rate, est soigneusement broyé et incubés dans le tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 14 ml de PBS, filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube Falcon de 50 ml et centrifuger pendant 5 min à 300g. </li><li> Retirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger pendant 5 min à 300g et retirer le surnageant par la suite. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 50 ul de PBS, ajouter des anticorps marqués par fluorescence pour identifier le type de cellule d&#39;intérêt (par exemple, CD3, B220, CD8 et CD4), et marqué par fluorescence CMH-I tétramère (CMH-II tétramère pour les cellules T CD4) chargée avec le peptide d&#39;intérêt à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1 mL de PBS, centrifuger pendant 5 min à 300 g de granulés, remettre en suspension dans 3 ml de PBS, et filtrer les cellules en suspension à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube. </li><li> Effectuer FACSorting en définissant les portes rigoureusement (figure 1B). </li></ol> 2. Noyaux de cellules somatiques Il ya quelques protocoles de transfert de noyau de cellule somatique. Celle décrite ici fait usage d&#39;ovocytes arrêtés en métaphase II et l&#39;inhibition de la seconde division méiotique utilisant cytochalasine B. Donc les cellules du donneur sont nécessaires, qui sont en phase de G0/G1. <ol><li> Préparation des ovocytes <ol><li> Des souris femelles BDF1 des antécédents sont injectés par voie intrapéritonéale avec 5IU PMS par souris 17:00-19:00. </li><li> Environ 47 heures plus tard, chaque souris est injecté par voie intra-péritonéale avec HCG 5IU. </li><li> Préparez une boîte de culture (KSOM-AA gouttes sous huile) pour les ovocytes, le même jour que l&#39;injection de HCG et les placer dans une étuve à 37 ° C, 5% de CO 2. En outre, de préparer les aiguilles nécessaires pour SCNT (7μm d&#39;énucléation et 4 ou 5 pm pour le transfert nucléaire de noyaux de lymphocytes) en les chargeant avec le mercure. </li><li> Euthanasier les souris et d&#39;isoler les oviductes environ 13h après l&#39;HCG (environ 8 heures). Recueillir les oviductes de 1-2 gouttes de HCZB. </li><li> Un par un seul mouvement les oviductes dans une goutte contenant M2 w / hyaluronidase. Nick l&#39;oviducte soigneusement avec une pince et déplacer l&#39;ovocyte-cumulus-complexe dans la goutte. Après tout ovocyte-cumulus-complexes ont été isolés, le plat est incubé à 37 ° C. </li><li> Après 2-5 min (le temps exact dépend du lot de hyaluronidase) recueillir les ovocytes, lavez-les à HCZB et la plaque eux dans KSOM-AA gouttes. </li></ol></li><li> Énucléation de l&#39;ovocyte <ol><li> Utilisez le couvercle d&#39;une boîte de Pétri pour préparer la plaque TNCS. Mettre en place le microscope, et le micromanipulateur. </li><li> Lavez l&#39;aiguille énucléation (7 pm) en PVP avant de commencer avec une énucléation. </li><li> Pour l&#39;énucléation, place un groupe d&#39;ovocytes (10-30) dans une goutte d&#39;HZCB par la cytochalasine B (5 pg / ml). Alors que l&#39;incubation (min. 5 min) gamme des ovocytes horizontalement. </li><li> Prendre un ovocyte et le placer en face de l&#39;aiguille de maintien. Fixer l&#39;ovocyte à l&#39;aiguille tenant en appliquant un vide. Utilisation de l&#39;aiguille énucléation, tournez l&#39;ovocyte jusqu&#39;à la broche-chromosome complexes (SCC, souvent appelé le «noyau») est en position 03 heures. </li><li> Utilisant des dispositifs piézo-impulsions pénétrer la zone pellucide soin, sans endommager l&#39;ovocyte. Placez l&#39;ouverture de l&#39;aiguille adjacente à la broche métaphase II et appliquer le vide. Le &quot;noyau&quot; devrait se déplacer lentement dans l&#39;aiguille, et la membrane doit se joint une fois qu&#39;il est complètement supprimé. </li><li> Transférer les ovocytes énucléés de nouveau dans les gouttes KSOM-AA, et lavez-les plusieurs fois. Répétez l&#39;eétapes de nucléation avec un nouveau groupe d&#39;ovocytes. Continuez jusqu&#39;à ce que tous les oeufs sont énucléés, ou jusqu&#39;à 11 heures environ. </li></ol></li><li> Transfert nucléaire <ol><li> Pour le transfert nucléaire, l&#39;échange de l&#39;aiguille d&#39;énucléation (7 um) avec une aiguille de transfert nucléaire (4 ou 5 um) et le laver avec de PVP. </li><li> Placez vos cellules d&#39;intérêt (par exemple cellules T CD8 +) dans une goutte avec PVP, bien mélanger et laisser incuber pendant une période minimale de 10 min. </li><li> Placer un groupe d&#39;ovocytes énucléés (10-30) dans une goutte d&#39;HCZB par la cytochalasine B (2,5 pg / mL). Alors que l&#39;incubation (min. 5 min) gamme ovocytes horizontalement en utilisant l&#39;aiguille de transfert nucléaire. </li><li> Ramassez une cellule donneuse de la suspension de PVP-cellulaire et l&#39;aspirer au-and-out jusqu&#39;à ce que la membrane externe est en panne (des fragments de la membrane et le cytosol doit être visible). Si nécessaire, un piézo-impulsions peuvent être appliqués. Une fois un noyau a été isolé, déplacez-le un peu dans l&#39;aiguille, et de continuer à ramasser des noyaux jusqu&#39;à ce que vous avez 10-30. </li><li> Déplacer vers la goutte contenant les ovocytes énucléés alignés. Fixer un ovocyte à l&#39;aiguille tenant en appliquant un vide. Placez l&#39;aiguille de transfert nucléaire (les noyaux doivent être éloignées de l&#39;ouverture) adjacent à la zone pellucide et appliquer piézo-impulsions jusqu&#39;à ce que l&#39;aiguille a traversé la zone pellucide. Soigneusement passer un noyau à la pointe de l&#39;aiguille, enfoncer l&#39;aiguille dans l&#39;ovocyte jusqu&#39;à la pointe de l&#39;aiguille est de 2 / 3 à l&#39;intérieur. Appliquez une petite pression négative, de sorte que d&#39;un peu de la membrane ovocytaire est dans l&#39;aiguille. </li><li> La prochaine étape est très critique, car c&#39;est le seul moment où l&#39;ovocyte est réellement «ouvert». Appliquer une seule impulsion de piézo, poussez le noyau de l&#39;aiguille en appliquant une pression positive, soigneusement retirer l&#39;aiguille pour que la pointe est d&#39;environ 1 / 3 dans l&#39;ovocyte, puis appliquer une pression négative et de continuer à reculer l&#39;aiguille joint l&#39;ovocyte. Répétez cette étape avec chaque ovocyte. </li><li> Après tout ovocytes d&#39;un groupe ont reçu un noyau, elles sont lavées et cultivées dans KSOM-AA médias. Répétez cette procédure avec tous les ovocytes. </li><li> Après le dernier groupe a été cultures dans KSOM-AA pour un minimum de 30 min, le SCNT-embryons sont transférés dans des gouttes d&#39;activation des médias Ca libre contenant SrCl2. </li><li> Après 6 heures d&#39;activation, le montant de la pseudo-pronuclei (PPN)-positifs TNCS embryons est déterminé. Les embryons sont ensuite lavées et cultivées dans KSOM-AA gouttes pour 3,5 jours supplémentaires jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient atteint le stade de blastocyste. </li><li> Les médicaments ou les produits chimiques de choix (comme trichostatine A) peut être ajouté à l&#39;activation et les milieux de culture. </li></ol></li></ol> 3.Derivation des cellules souches embryonnaires Les blastocystes TNCS peut être utilisé soit pour les transférer dans des pseudo-gravides (aussi connu comme le clonage direct ou en une seule étape) ou de dériver des cellules souches embryonnaires (également connu comme le clonage indirect ou deux étapes). Comme il est beaucoup plus efficace pour générer des cellules ES, nous choisissons la procédure en deux étapes. Dans le cas où le chercheur est intéressé par clonage direct, les blastocystes peuvent être transférées directement dans la pseudo-gravides comme décrit dans la section 5. Il ya de nombreux protocoles décrivant la dérivation de cellules souches embryonnaires. Celle décrite ici est une technique standard, qui utilise des cellules nourricières et de sérum de veau foetal. <ol><li> Le deuxième jour après le transfert nucléaire, préparer une plaque de 96-U-même pour la dérivation de cellules souches embryonnaires. </li><li> Ajouter 100 uL de gélatine dans chaque puits d&#39;une plaque 96-U-même, incuber pendant un minimum de 10 min, et ensuite il supprime. </li><li> Cellules nourricières Décongeler et remettre en suspension dans un volume en fonction du milieu de l&#39;EDD, par exemple des cellules nourricières équivalent à une surface de 25 cm 2 sont remis en suspension dans 10 ml de milieu ESD et 200 pi de la suspension cellulaire sont ajoutés dans chacun des gélatine bien traités. </li><li> Mettez la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Après 3,5 jours, les embryons doivent être au stade de blastocyste. </li><li> Préparer un plat stériles bactérienne en plaquant un médium quelques gouttes de cellules ES et thyrode acide. </li><li> Les blastocystes sont d&#39;abord transférés de la chute KSOM-AA en gouttes contenant normales moyennes de cellules ES et lavées deux fois. </li><li> Soigneusement le transfert d&#39;un groupe de blastocystes (blastocystes 5-10) en une seule goutte d&#39;acide thyrode et gardez là jusqu&#39;à ce que la zone pellucide a dissous. </li><li> Les blastocystes sont ensuite transférés dans une goutte de moyenne ES, lavées deux fois, puis placé dans le chargeur de revêtement 96-U-même la plaque (un blastocyste dans un puits). </li><li> Les embryons sont ensuite cultivés pendant 5-7 jours dans un incubateur à 37 ° C CO, 5% 2 sans les déranger. Cela donne le temps d&#39;embryon à unttach à la couche d&#39;alimentation, et de former une excroissance. </li><li> Préparer des plaques 24 puits, en placage de mangeoires dans le milieu de l&#39;EDD dans chaque puits, par exemple resuspendre l&#39;équivalent de 50 cm 2 de desserte dans 12 ml moyennes EDD, et ajouter 500 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits. </li><li> Retirer délicatement le support de la plaque ESD 96-U-bien avec les embryons, laver chaque puits deux fois avec 250 uL Hepes (ou PBS), ajouter 50 uL trypsine et incuber pendant environ 5 min à 37 ° C. </li><li> Pipette de haut en bas plusieurs fois, jusqu&#39;à ce que l&#39;excroissance s&#39;est effondré en une suspension à cellule unique, le transfert dans une plaque de 24 puits et incuber à 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Si la dérivation CES a réussi, les colonies ESC doit être visible après 7-10 jours. </li></ol> D&#39;injection 4.Blastocyst L&#39;injection de blastocystes est une technique de routine pour générer n&#39;importe quel type de modèle de souris transgénique. Il est important de mentionner que l&#39;injection de blastocystes et le transfert subséquent en pseudo-gravides doit être chronométré bien. <ol><li> Premier souris femelles avec PMS et HCG comme décrit dans la section 2.1. Après l&#39;injection de HCG mis les souris femelles avec des souris mâles (une femelle et un mâle de souris par cage). </li><li> Le lendemain, vérifiez les femelles pour les bouchons. Ceci est compté comme 0.5dpc (jours après le coït). </li><li> Embryons fécondés sont ensuite isolés de l&#39;oviducte comme décrit dans la section 2.1, et cultivées dans KSOM-AA pour trois jours supplémentaires. </li><li> Préparer les cellules ES sur le jour de l&#39;injection blastocyste (3.5dpc). </li><li> Retirer moyennes à partir des cellules ES, laver deux fois avec HEPES (ou PBS), ajouter la trypsine et incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules trypsinisées à moyen ES, plaque dans un plat, et incuber pendant 45-60 min à 37 ° C, 5% de CO 2 pour réduire la quantité de cellules nourricières (cellules nourricières adhèrent plus rapidement que les cellules ES). </li><li> Transférer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube et centrifuger pendant 5 min à 1000rpm. </li><li> Retirer le surnageant, la cellule Resuspendre le culot dans 500 uL moyennes ES et de stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer le couvercle d&#39;une boîte stérile bactérienne par des gouttes plaquage contenant PVP et HCZB. </li><li> Préparer une aiguille 15 um en chargeant avec le mercure, le plaçant en position et le laver avec de la PVP. </li><li> Placer un groupe de blastocystes (10-30 blastocystes) dans une goutte avec HCZB, et ajouter 50 à 50 uL de suspension de cellules ES (dépend de la concentration) dans une autre goutte de HCZB. </li><li> Ramassez les cellules ES (50-100 cellules) avec l&#39;aiguille d&#39;injection. </li><li> Déplacer à la baisse avec les blastocystes. Alignez les blastocystes horizontalement, et de fixer un avec l&#39;aiguille tenant en appliquant un vide. </li><li> Utilisation de l&#39;aiguille d&#39;injection tourner le blastocyste jusqu&#39;à ce que la masse cellulaire interne (ICM) est à la position 09 heures. </li><li> Placez votre aiguille d&#39;injection à 03 heures, assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de cellules ES à la pointe de l&#39;aiguille, et d&#39;appliquer piézo-impulsions jusqu&#39;à ce que l&#39;aiguille d&#39;injection pénètre à travers la zone pellucide et le trophectoderme dans le blastocèle. </li><li> Libérer une cellules ES quelques (5-15 cellules), de sorte que les cellules ES coller à l&#39;ICM. Continuez jusqu&#39;à ce que tous les blastocystes d&#39;un groupe ont été injectées avec des cellules ES. </li><li> Après un groupe de blastocystes est terminée, les laver deux fois dans KSOM-AA et gardez-les dans une goutte avec KSOM-AA jusqu&#39;à ce que tous les blastocystes sont injectés. </li></ol> 5. Transfert d&#39;embryons Le transfert des embryons dans les pseudo-gravides représente une intervention chirurgicale, qui doit être effectué très soigneusement et selon les directives de l&#39;institut du chercheur. <ol><li> Anesthésier souris receveuses femelles, se raser quadrant inférieur droit, et à désinfecter. </li><li> Utiliser des ciseaux ouvrir la peau, et séparé du péritoine de la peau. </li><li> Localisez l&#39;ovaire à travers le péritoine (tache rouge), et d&#39;ouvrir le péritoine à proximité de l&#39;ovaire. </li><li> En utilisant une pince, soigneusement attraper l&#39;oviducte et sortir de l&#39;utérus. </li><li> Procurez-vous un groupe d&#39;environ 10 blastocystes avec un capillaire relié à une pipette bouche. </li><li> Fixer l&#39;utérus avec une pince, faites un tout petit en elle avec une petite aiguille, et insérez le capillaire avec des blastocystes dans le lumen de l&#39;utérus. </li><li> Soigneusement libérer les embryons dans l&#39;utérus, et supprimer vos capillaire. </li><li> Poussez l&#39;utérus dans la cavité abdominale. </li><li> Repérez les bords du péritoine et de le fermer avec quelques points de suture. </li><li> Fermer la peau de la souris avec un peu d&#39;agrafes. </li><li> Pour douleur post-opératoire, administrer 5 mg carprofène par mg de poids corporel. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Noyaux de cellules somatiquestransfert de lymphocytes T pré-défini dans B6CF1 fond. Les chiffres absolus et relatifs des embryons générés à partir des cellules CD8 + T et les cellules souches embryonnaires dérivées de blastocystes TNCS. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Analyse des flux Représentant cytométrie de souris chimériques injecté avec TNCS cellules souches embryonnaires. Porte et le nombre (au total pour cent par les lymphocytes T CD8 +) indique la présence de certaines cellules CD8 + T chez les souris chimériques.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Nous avons montré ici que SCNT peut être utilisée pour générer des souris Transnuclear partir des cellules T avec des pré-défini la spécificité. Bien que non représenté ici, la technique devrait également être utilisable pour générer des souris Transnuclear partir de cellules B avec pré-défini la spécificité. Une chose importante à considérer est la souche et le sexe des souris, qui est infecté ou immunisé et utilisée pour isoler des cellules T ou B de l&#39;intérêt. Comme les cellules T et B ont un rendement très faible reprogrammation en général, nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;hybrides F1 haplotype désiré. Parce que la cellule donneuse détermine aussi le sexe, nous recommandons l&#39;utilisation T ou les cellules B de souris mâles. Cela signifie que seuls mâles souris chimériques transmettrait le TCR ou BCR travers la lignée germinale, avec les souris mâles étant plus facile et plus rapide pour se reproduire. Pris ensemble, nous pensons que la reprogrammation épigénétique par TNCS représente un outil puissant pour générer un nouveau type de modèles de souris, qui sera un grand avantage pour le domaine de l&#39;immunologie.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Les lymphocytes, comme les cellules T, subir génétique V (D) J, pour générer un récepteur avec une certaine spécificité 1. Souris transgéniques pour un antigène spécifique réarrangés récepteur des cellules T (TCR) ont été un outil indispensable pour étudier le développement des cellules T et leur fonction. Toutefois, ces TCR sont généralement isolées à partir des cellules T après pertinente à long terme de la culture souvent après stimulation antigénique répétée, qui sélectionne inévitablement des cellules T avec une haute affinité. Aléatoire intégration génomique du TCR α-β et de la chaîne et l&#39;expression du non-endogènes promoteurs peuvent conduire à des variations dans le niveau d&#39;expression et de la cinétique. Reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire de cellule somatique offre un outil pour générer des cellules souches embryonnaires et les souris d&#39;une cellule d&#39;intérêt. Par conséquent, lorsque TNCS est appliquée aux cellules T de spécificité connue, ces génétiques V (D) J réarrangements sont transférés à des cellules souches embryonnaires SCNT (CES) et les souris qui en sont dérivés, tandis que les marques épigénétiques sont réinitialisés. Nous avons démontré que les cellules T avec pré-défini les spécificités contre Toxoplasma gondii peut être utilisé pour générer des modèles de souris qui expriment la TCR spécifique de leur locus endogène, sans modification génétique introduite expérimentalement. La relative facilité et la rapidité avec laquelle ces modèles peuvent être obtenus Transnuclear est prometteuse pour la construction de modèles d&#39;autres maladies.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.

Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K vues.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Recherche

Immunologie et infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

Méthode de dépistage à cellule unique pour la sélection et la récupération d'anticorps ayant les spécificités souhaitées des populations enrichies de cellules de la mémoire humaine B

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...