Nous remercions l&#39;ensemble du laboratoire Koshy pour des discussions utiles. Nous remercions Patty Jansma et de l&#39;Université de l&#39;Arizona Département Neuroscience conseiller et vous aider avec l&#39;imagerie. Nous remercions également le laboratoire Porreca pour l&#39;utilisation de leur Vibratome. Cette recherche a été financée par le National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

NOTE: Les souris ont été élevées et maintenues dans une pièce à température contrôlée et l&#39;humidité de 12 h inversée cycles lumière / obscurité avec de la nourriture et de l&#39;eau disponibles ad libitum à l&#39;Université de l&#39;Arizona. Des expériences ont été menées conformément aux lignes directrices et approbation du soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université de l&#39;Arizona. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Les souris Cre-reporters sont sur ​​une souris C57BL / 6 de fond 11 et sont disponibles dans le commerce. 1. Infection souris REMARQUE: La méthode d&#39;infection de la souris par Toxoplasma gondii décrit ci-dessous a été utilisé dans les études publiées antérieurement 10-12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cultiver les souches de Toxoplasma en fibroblastes de prépuce humain (HFF) cultivés en haut glucose de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 mg / ml streptomycin, et 2 mM de L-glutamine (cDMEM) dans un ballon T-25 dans un incubateur à CO2 à 5% jusqu&#39;à ce que les parasites ont formé de grandes vacuoles parasitophores. </li><li> Parasites Seringue à libération par grattage des cellules du fond de la fiole et faire passer la solution résultante à travers une aiguille de calibre 25 reliée à une seringue de 3 ml deux fois à l&#39;intérieur de la fiole puis transférer toute la solution à un boîtier de seringue 5 ml relié à une aiguille de calibre 27 qui a été placé à l&#39;envers à l&#39;intérieur d&#39;un tube conique de 15 ml. Connectez le piston sur la seringue et passer la solution du parasite dans le tube conique. </li><li> Centrifugeuse le tube pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant puis remettre en suspension le culot dans 4-6 qualité USP ml stérile 1x tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (solution mère). </li><li> Chargez un hémocytomètre avec 10 pi de solution mère, attendre 5-10 minutes pour les parasites de se installer puis de compter le nombre de parasites dans les quatre coins et au centre des carrés de la grande place centrale. </li><li> Diluer pardes sites à taille de l&#39;inoculum approprié de 100K / 200 ul PBS 1X puis injecter à des souris par voie intrapéritonéale (ip) avec un volume total de 200 pi. NOTE: Pour cette procédure, les souris ont été inoculées avec 100K de type III (CEP) 13 tachyzoïtes dans 200 ul PBS 1x. Lorsque infecter les souris avec d&#39;autres souches de Toxoplasma, la concentration d&#39;inoculum peut avoir besoin d&#39;être ajusté pour tenir compte de niveau de virulence. </li></ol> 2. Perfusion et récolte du cerveau Remarque: Ce protocole a été effectuée après l&#39;infection 21 jours (dpi), car cela représente le point auquel le nombre de pics de kystes sont présents dans le cerveau de souris de temps, mais d&#39;autres points dans le temps peut être utilisé. Taille, le nombre, l&#39;emplacement, et la présence ou l&#39;absence de kystes dépend de nombreux facteurs, y compris souche de souris, parasite type de souche ainsi que la taille de l&#39;inoculum 7,14 - 17. Les enquêteurs devront déterminer individuellement la inoculum approprié pour la souris et Toxoplassouche de ma il / elle utilise. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Configuration de tous les outils de récolte chirurgicales (Figure 1). </li><li> Pour chaque souris, préparer et garder sur la glace: 20ml seringue remplie de 0,9% de chlorure de sodium (NaCl) + 10 U / ml d&#39;héparine dans 1x qualité USP PBS stérile (héparine / Saline); Seringue de 20 ml rempli avec 4% de paraformaldehyde (PFA); Scintillation flacon avec 15 ml 4% PFA. Pour plusieurs souris, préparer un bécher rempli de la totalité du montant de chaque solution nécessaire pour toutes les souris alors établir une seringue pleine de fraîcheur et d&#39;une solution pour chaque perfusion. </li><li> Anesthésier la souris ip avec 200 pl / 25 g de poids corporel de kétamine / xylazine cocktail (24 mg / ml et 4,8 mg / ml) le jour de l&#39;intérêt. Surveiller la souris pour le niveau de l&#39;anesthésie en cochant pincement de l&#39;orteil réflexe. Continuer avec le protocole qu&#39;une seule fois la souris montre aucune réponse à une pincement de l&#39;orteil entreprise. NOTE: D&#39;autres méthodes d&#39;anesthésie peut être utilisé tant que le niveau approprié de l&#39;anesthésie est atteint avantle traitement de protocole. </li><li> Placez la souris en position couchée sur la plate-forme de mousse couverte. Epingler les quatre membres sur les pieds puis vaporiser la poitrine et l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol (EtOH) (figure 2A). Ajout de plusieurs serviettes en papier stériles sous la souris peut être utilisé pour aider à absorber débordement de liquides de perfusion. </li><li> Ascenseur peau juste en dessous du sternum avec une pince puis utilisez des ciseaux pour faire une incision. Tirez la peau pour exposer la poitrine (figure 2B). </li><li> Soulevez xiphoïde processus et faire une incision abdominale juste en dessous du diaphragme, exposer le foie qui est carrément disséquée du diaphragme. Faire deux incisions, l&#39;une à gauche et une à droite à travers le diaphragme et le fond des côtes. Étendre les incisions gauche et droite d&#39;environ 1 / 2-2 / 3 chemin jusqu&#39;à la cage thoracique, qui est ensuite renvoyée pour ouvrir la cavité thoracique (figure 2C). REMARQUE: Prenez soin de ne pas couper tous les organes ou des gros vaisseaux sanguins Dusonner cette procédure car cela pourrait compromettre la qualité de la perfusion. </li><li> Perfuser transcardiaque avec 10-20 ml d&#39;héparine / Saline suivie par 10 à 20 ml 4% PFA. NOTE: Si la perfusion est fait correctement, le foie se met du rouge à bronzer (figure 2D). Si ne pas fait correctement, les vaisseaux sanguins seront visibles (figure 2E). </li><li> Retournez la souris sur son abdomen, re-broches pieds pulvérisent alors à la tête et le cou avec EtOH à 70%. Soulevez la peau de la base du cou et de faire une incision. Enlever la peau pour exposer le crâne (figure 2F). Décapiter la tête au niveau des épaules. Retirez le crâne, retirez délicatement le cerveau, et le placer dans un flacon à scintillation rempli de 4% PFA (Figure 2G-H). NOTE: Si bien perfusé, le cerveau apparaît blanc avec pas de vaisseaux sanguins visibles (Figure 2I). Si le cerveau ne est pas bien perfusé, les vaisseaux sanguins seront visibles (Figure 2J). </li><li> Placez le Scintillation flacon avec le cerveau dans 4% PFA à 4 ° C pendant la nuit, couvert de la lumière. Rincer le cerveau dans la non-qualité USP 1x PBS et le transfert à un nouveau flacon de scintillation rempli de frais 1x PBS. Rangez le cerveau 1x PBS à 4 ° C, couvert de la lumière. REMARQUE: compensation réussie et l&#39;imagerie a été accompli avec sections stockées dans 1x PBS pendant jusqu&#39;à un mois, mais il est préférable de l&#39;article le cerveau en quelques jours que le stockage prolongé dans PBS va renverser la fixation PFA et pourrait conduire à moins de images optimales . Autofluorescence et l&#39;augmentation de flou ont été constatées dans certaines sections imagées après stockage dans 1x PBS pendant un mois ou plus. </li></ol> 3. cerveau sectionnement <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirer le cerveau de 1x PBS et le placer dans une matrice du cerveau (figure 3A) pour permettre plus précis et coupe même à travers le cerveau. Coupez le cervelet et olfactives ampoules, se il est présent, et puis couper le cerveau coronaire en 2 ou 3 sections. <br /&gt; NOTE: Découper et couper du cerveau peut être fait sans l&#39;aide d&#39;une matrice de cerveau. Nombre de sections découpées coronaire dépend de la distance de coupe de la Vibratome utilisé. Le cerveau peut être sectionnée dans ne importe quelle orientation, si les articles sagittal et coronal sont les plus couramment utilisés pour l&#39;identification neuroanatomiques. </li><li> Fixer chaque section de cerveau sur un bloc de montage de spécimen de cyanoacrylate. Apposer un petit bloc de gel d&#39;agarose à 5% derrière la section du cerveau de soutien (figure 3B). NOTE: D&#39;autres mécanismes de soutien peuvent être utilisés, mais sans le soutien, l&#39;Vibratome peuvent pousser sur le cerveau causant sectionnement inégale. </li><li> Couper le tissu dans 160 um (distance de travail de l&#39;objectif utilisé pour l&#39;imagerie) d&#39;épaisseur avec des sections Vibratome la réglés à une vitesse de 4 et de l&#39;amplitude de neuf. REMARQUE: Les paramètres de vitesse et l&#39;amplitude peuvent être ajustées en fonction de la machine particulier utilisé afin d&#39;obtenir même, sections lisses. Si les paramètres sontpas correct, le résultat peut être sections inégales, déchirure des marques de tissus ou de bavardage. </li><li> Recueillir des coupes de tissus dans un flacon de scintillation rempli de frais, réfrigérés 1x PBS se ils vont être réglés en moins d&#39;une semaine. Si les sections ne vont pas être réglés dans une semaine, place des sections dans 1,5 ml microtubes remplis de solution de cryoconservation et conserver à -20 ° C. </li></ol> 4. compensation optique des coupes de tissus du cerveau NOTE: Ce protocole a été modifié d&#39;une méthode déjà publié huit. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Préparer 25%, 50%, 75% et 90% en volume / volume de glycerol dans du PBS 1x + 2% de Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Retirer sections de 1x PBS ou, en cas de cryoconservation, rincer à 1x PBS et transfert à un flacon à scintillation contenant 10 ml de 25% Gl / PBST. Lieu flacon sur un agitateur à 4 ° C, couvert de l&#39;exposition à la lumière, pendant 12 heures. </li><li> Vérifiez que toutes les sections ont coulé au boTTOM du flacon. Aspirer le 25% Gl / PBST, laissant juste assez pour couvrir les sections Ensuite, remplissez le flacon avec 10 ml 50% Gl / PBST et lieu sur un agitateur à 4 ° C, couvert de l&#39;exposition à la lumière, pendant 12 heures. Répétez ce processus pour les 75% Gl / PBST puis 90% Gl / PBST. Laissez sections dans le 90% Gl / PBST pendant 24 heures pour atteindre la compensation maximale. Au cours du processus de compensation, observer compensation optique progressive (figure 4). NOTE: Ce processus peut être accéléré si des solutions sont modifiées immédiatement après sections ont coulé au fond du flacon. Dans 75% et 90% des solutions, les articles ne seront pas couler tout le chemin vers le bas du flacon, mais flottent au milieu. </li></ol> 5. montage coupes de tissus cérébraux <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coupez un n ° 1,5 lamelle en 5 morceaux pour créer une entretoise. Utilisez un crayon de règle et diamanté de marquer et de briser la lamelle le long des lignes discontinues sur la figure 5A. Jeter tqu&#39;il pièce centrale, disposer les quatre pièces extérieures sur une lame de verre clair pour créer une fenêtre, puis brosser vernis à ongles transparent sur ​​les coutures pour faire adhérer les pièces de l&#39;entretoise à la diapositive dans la configuration correcte (figure 5B). NOTE: L&#39;entretoise sera utilisé pour créer l&#39;espace nécessaire entre la lame et la lamelle pour le montage des sections dégagées. La lamelle peut être découpé en différentes façons de créer ne importe quelle fenêtre de la taille nécessaire. Prédécoupées cales en mousse sont également disponibles dans le commerce. Pour permettre vernis à ongles pour sécher complètement, il est préférable de faire des diapos avec entretoises au moins un jour avant sections de montage. </li><li> sections de transfert à une diapositive à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique avec la pointe coupées. Assurez-vous de remplir environs avec 90% Gl / PBST. Abaissez délicatement une lamelle sur les sections en veillant à ne pas introduire de bulles. Excédent Gl / PBST peut être évacuée avec une lingette non pelucheux. </li><li> Image GFP + neurones contenant DP + <em&gt; Kystes de Toxoplasma gondii avec un microscope confocal immédiatement (Figure 7A-B), puis conserver les lames plat et recouvert de la lumière à 4 ° C. REMARQUE: Sinon, joint glisse complètement autour de tous les bords pour stocker et imagées à une date ultérieure. L&#39;utilisation de vernis à ongles transparent pour sceller diapositive est facultative et peut rendre plus difficile à enlever lamelle si l&#39;on devait supprimer des sections de la diapositive à une date ultérieure pour un traitement ultérieur. </li></ol> 6. Imaging NOTE: Toute microscope peut être utilisé qui a la capacité d&#39;obtenir haute résolution z-piles. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Après avoir initialement constaté le plan focal à 10X, changer pour un objectif 20X et parcourir la section d&#39;identifier un kyste situé à l&#39;intérieur d&#39;un GFP + cellule. Centrer la région d&#39;intérêt (ROI) dans le champ de vision. </li><li> Changer pour un objectif 40X. Concentrer et à travers l&#39;ensemble du ROI pour se assurer que l&#39;ensemble de la cellule et CYst sont visibles. REMARQUE: Les images ont été obtenues en utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1,30 Huile DIC M27. </li><li> Utilisation du logiciel d&#39;imagerie installé, obtenir un z-pile qui comprend la totalité de la cellule avec kyste. Moyenne des paramètres utilisés pour obtenir des images sont représentées à la figure 6. peuvent avoir besoin d&#39;être ajusté en fonction de chaque section enquêteurs de tissus et les capacités de microscope Réglages: NOTE. </li><li> Obtenir une image maximale de projection de la z-stack en définissant le nombre de projections à 1. Obtenir une vue complète de rotation en définissant le nombre de projections à 64 ans. REMARQUE: Les autres logiciels sont disponibles et peuvent être utilisés pour obtenir projection maximale, de rotation ainsi que d&#39;autres points de vue des images z-stack. </li><li> Analyser image avec un logiciel d&#39;analyse d&#39;imagerie. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Étant donné que les changements cellulaires dans des cellules hôtes infectées ont été liés aux résultats de la maladie dans les infections avec d&#39;autres organismes intracellulaires tels que le VIH, la rage, et Chlamydia 18,19, nous avons développé une technique qui nous permettrait d&#39;étudier les interactions intimes qui surviennent entre le CNS Cellule hôte et Toxoplasma. La méthode décrite ici atteint cet objectif en permettant l&#39;imagerie efficace des neurones infectés chr...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;obtenir des images haute résolution en trois dimensions de neurones individuels qui sont infectés par le parasite intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii. Toxoplasma est souvent considéré comme l&#39;un des parasites les plus réussies en raison de sa large gamme de hôte intermédiaire, qui comprend les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, après l&#39;infection aiguë par ingestion d&#39;aliments ou d&#39;eau contaminés, Toxoplasma est capable de provoquer une infection persistante du SNC par la conversion de sa forme de réplication rapide (la tachyzoïte) à sa lente réplication et enkyster forme (l&#39;bradyzoïte ). Chez les individus immunocompétents, cette infection latente CNS est pensé pour être relativement asymptomatiques, mais chez les personnes immunodéprimées comme les sidéens ou les receveurs de greffe, la recrudescence du parasite peut conduire à toxoplasmose cérébrale fatale 1,2. En outre, des études récentes have montré que l&#39;infection latente par Toxoplasma peut conduire à des changements de comportement chez les rongeurs 3,4, bien que le mécanisme reste inconnu. Étonnamment, malgré ces données soulignant l&#39;importance de l&#39;interaction CNS- Toxoplasma, on sait relativement peu de cette relation, en particulier au niveau cellulaire et moléculaire. La possibilité d&#39;étudier les aspects même les plus simples de l&#39;interaction cerveau-parasite a été entravée en partie par des limitations technologiques. Par exemple, la majeure partie du travail montre que les neurones sont les cellules dans lesquelles persistent kystes a été fait avec la microscopie électronique (EM) 5,6. Bien EM donne haute résolution, il est temps, de main-d&#39;œuvre, et coûteux. Immunofluorescence (IF) les essais ont été récemment utilisé en conjonction avec la microscopie confocale pour confirmer le travail effectué par EM 7. Si les analyses sont techniquement facile à réaliser et relativement peu coûteux, mais l&#39;utilisation de ces techniques pour undertand la relation spatiale entre le kyste et le neurone infecté nécessite la reconstruction de série, qui prend du temps, techniquement difficile, et peut conduire à la perte d&#39;informations précieuses. Ainsi, nous avons développé une méthode qui peut être utilisé avec le modèle murin de la CNS toxoplasmose et nous permet de l&#39;image l&#39;ensemble des neurones infectés sans EM ou immunohistochimie (IHC). En développant une telle technique, nous pouvons commencer à explorer la relation cellulaire entre la cellule infectée et le kyste d&#39;une manière relativement rapide et peu coûteuse. Le procédé que nous avons développé combine les techniques actuellement disponibles pour la compensation optique et des coupes de cerveau épaisseur d&#39;imagerie par microscopie confocale à 8 avec un système qui marque dans les cellules in vivo qui ont été injectées avec des protéines parasitaires 9,10. Dans ce système, on infecte les souris Cre-rapporteurs qui expriment une protéine fluorescente verte (GFP) qu&#39;après la recombinaison médiée par Cre 11 par Toxoplasma </em&gt; Souches qui expriment une protéine fluorescente rouge (RFP) et se injectent la recombinase Cre dans les cellules hôtes 9. Cette combinaison nous permet de récolter le cerveau de souris infectée après l&#39;infection du système nerveux central est établi, couper des sections de cerveau épais, et identifier rapidement les domaines pertinents pour l&#39;image en trouvant la DP + kystes. Il est important de noter que l&#39;expression de la cellule hôte de la GFP dépend uniquement de l&#39;injection de Cre par des parasites, et non sur l&#39;infection, un certain nombre de cellules GFP + ne contiennent pas de parasites 10. Comme l&#39;objectif de ce protocole est de pouvoir neurones infectés images entières, l&#39;accent est mis uniquement sur ​​la GFP + neurones qui contiennent également un appel d&#39;offres + kyste, mais le protocole peut également être utilisé pour l&#39;image de la GFP + / DP - neurones. Une fois que le cerveau infecté est récolté et sectionnée, les sections sont rendus transparents par compensation glycérol. Régions appropriées des articles sont ensuite visualisés en microscopie confocale, alci-visualisation sans précédent de cellules hôtes infectées et les parasites enkystés dans leur intégralité. Ici, nous fournissons un protocole complet pour identifier, de compensation optiquement, et les neurones d&#39;imagerie infectés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire avec une large gamme d&#39;hôtes, y compris les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, Toxoplasma établit une infection persistante à vie dans le cerveau. Bien que cette infection du cerveau est asymptomatique dans la plupart des personnes immunocompétentes, dans le fœtus en développement ou les personnes immunodéprimées telles que les acquis syndrome d&#39;immunodéficience acquise (SIDA) des patients, cette prédilection pour et la persistance dans le cerveau peut entraîner une maladie neurologique dévastatrice. Ainsi, il est clair que l&#39;interaction Toxoplasma cerveaux est essentielle à la maladie symptomatique produite par Toxoplasma, mais nous avons peu de compréhension de l&#39;interaction cellulaire ou moléculaire entre les cellules du système nerveux central (SNC) et le parasite. Dans le modèle murin de la CNS Toxoplasmose il a été connu plus de 30 ans que les neurones sont les cellules dans lesquelles le parasite persiste, mais peu d&#39;informations sont disponibles sur ce quipartie du neurone est généralement infecté (soma, dendrites, axone) et si cette relation cellulaire change entre les souches. En partie, ce manque est secondaire à la difficulté de l&#39;imagerie et la visualisation des neurones infectés entiers d&#39;un animal. De telles images ne nécessite généralement coupes sériées de tissu et les coutures imagées par microscopie électronique ou la microscopie confocale après immunomarquage. En combinant plusieurs techniques, le procédé décrit ici permet d&#39;utiliser des sections épaisses (160 pm) afin d&#39;identifier et de cellules d&#39;image entière qui contiennent des kystes, ce qui permet la visualisation et l&#39;analyse des différents neurones, une infection chronique à trois dimensions sans avoir recours à l&#39;immunomarquage, microscopie électronique ou coupes sériées et les coutures. En utilisant cette technique, nous pouvons commencer à comprendre la relation cellulaire entre le parasite et le neurone infecté.

Figure 7 comprend des images représentatives de deux GFP + neurones à partir de deux sections 160 um d&#39;épaisseur différentes, ainsi que d&#39;une mesure représentative de la distance à partir de kyste à cellule-corps de la figure 7B. Chiffres contenant kyste 7-A et B montrent que cette nouvelle protocole permet la visualisation du neurone infecté dans son intégralité. La figure 7C montre que cette technique de f...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

En utilisant ce protocole, nous avons pu coupes de cerveau l&#39;image d&#39;épaisseur de 160 um à partir de souris infectées par le parasite Toxoplasma gondii, qui permet la visualisation et l&#39;analyse de la relation spatiale entre le parasite de enkyster et le neurone infecté.

Imagerie 3-D et de l&#39;analyse des neurones infecté<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K vues.  University of Arizona.  En utilisant ce protocole, nous avons pu coupes de cerveau l'image d'épaisseur de 160 um à partir de souris infectées par le parasite Toxoplasma gondii, qui permet la visualisation et l'analyse de la relation spatiale entre le parasite de enkyster et le neurone infecté. 

Vidéo: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Évolutif fluidique Arrays Injecteur pour virale ciblage d&#39;Intact circuits du cerveau en 3-D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Recherche

Neurosciences

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagerie optique des neurones dans le ganglion de crabe Stomatogastric avec tension colorants sensibles

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modification d&#39;un Colliculo-thalamocortical cerveau de souris Slice, Intégrer l&#39;impression 3-D de la Chambre des composants et multi-échelle imagerie optique

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Imagerie multimodale et analyse du modèle de néovascularisation choroïdienne souris induite par Laser

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.