Ce travail a été soutenu par l&#39;US Army Medical Research et le Commandement du matériel octroi # 05178001 et par NS041069-06 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies. Nous remercions Joël Vonnahme des commentaires utiles sur le protocole.

1. Cellule AGS souches neurales et les médias Préparation <ol><li> Adulte hippocampique écureuil au sol de l&#39;Arctique (AGS) des cellules souches neurales isolées dans une manière décrite précédemment 9 peut maintenant être obtenu commercialement comme flacons cryopréservés. Les cellules sont expédiés dans des emballages nuit isolée contenant de la glace sèche pour s&#39;assurer que les cellules restent dans un état cryopréservés. Pour maintenir l&#39;intégrité, déballer les cellules immédiatement après la réception et stocker à plus bas que -150 ° C, ou dans la phase vapeur de l&#39;azote liquide Dewar. </li><li> Préparer agsNSC milieu de base + 5% de FBS en ajoutant 5 ml de FBS (LS-1012) à 95 ml agsNSC milieu de base </li><li> Préparer moyen d&#39;extension agsNSC en ajoutant 500 B-27 uL Supplément (Invitrogen) à 50 mL agsNSC milieu de base. Répartissez le reste de la B27 dans 1mL aliquotes et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Chaude 25 ml de milieu de base + 5% agsNSC FBS et 20 ml de milieu Expansion agsNSC dans un bain à 37 ° C l&#39;eau. </li><li> Manteau flacons utilisés pour l&#39;expansion de poly-L-ornithine <ol><li> Décongelez la solution de poly-L-ornithine (10 pg / ml) de travail. Conserver la solution à 2-8 ° C pendant jusqu&#39;à un mois une fois décongelé. </li><li> Ajouter 8 ml de poly-L-ornithine solution de travail à l&#39;un ventilé T-75 flacon et répartir uniformément la solution sur toute la surface de culture de la fiole. (Ajuster quantité de solution de travail pour les navires de la culture d&#39;autres qui peuvent être utilisés Utiliser 0,5 -.. 1,0 ml de poly-L-ornithine solution de travail par 10 cm de surface de culture 2) </li><li> Incuber flacons à 37 ° C pendant un minimum de 24 heures. (L&#39;utilisation d&#39;un incubateur sans ajouter du CO 2 est préféré pour l&#39;incubation de poly-L-ornithine récipients de culture enduits.) Flacons couchés peuvent être stockées pendant jusqu&#39;à deux semaines dans l&#39;incubateur. </li><li> Avant d&#39;utiliser, aspirer poly-L-ornithine solution de travail de la fiole et laver deux fois avec de l&#39;eau stérile pour culture de tissus. Aspirer le liquide jusqu&#39;à ce que le flacon est presque à sec avant utilisation. </li></ol></li><li> Supprimer un flacon de la Dewar et vérifier que le bouchon du flacon est correctement scellé. Tenir le haut du flacon en laissant la moitié inférieure de la fiole dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant environ 60-90 secondes ou jusqu&#39;à ce que le flacon est presque complètement décongelés; une petite quantité de glace doit toujours être visible. Pour éviter une contamination potentielle, gardez le bouchon du flacon de l&#39;eau. Ne pas trop dégel, car cela pourrait endommager les cellules. </li><li> Vaporiser l&#39;extérieur de la fiole avec de l&#39;éthanol à 70% ou isopropanol, puis placer le flacon dans une enceinte de sécurité biologique. Retirez le bouchon avec précaution pour éviter la contamination ou les éclaboussures. </li><li> Doucement remettre en suspension les cellules dans le flacon en ajoutant 1 ml de milieux de base agsNSC + 5% de FBS aide d&#39;une pipette stérile. Transférer les cellules remises en suspension à 25 ml d&#39;eau tiède moyen basal agsNSC + 5% SVF dans un tube à centrifuger de 50 ml. </li><li> Rincer la cryo-flacon une fois avec la suspension cellulaire diluée. Centrifuger les cellules à 150 xg pendant 6 minutes. Pour de meilleurs résultats, calculer la vitesse pour chaque type de centrifugeuse individuelle. </li><li> Alors que les cellules sont filer vers le bas, ajoutez 10 ml de milieu d&#39;expansion à l&#39;agsNSC sèche de poly-L-ornithine T-75 revêtement des fioles, ajouter 40 ul de rh FGF-base (40ng/mL). Après la centrifugation, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot. Re-suspendre les cellules dans 10 ml de milieu Expansion agsNSC. Transférer les cellules remises en suspension dans un milieu de agsNSC expansion dans les médias dans le ballon de T-75. </li><li> Secouez doucement le récipient de culture côte à côte afin de répartir uniformément les cellules dans le vaisseau. </li><li> Récipient de culture ensemencée en place de 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Les cellules doivent attacher le ballon et commencent à former des processus dans les deux heures de l&#39;ensemencement. Si les cellules restent flottants et en boule dans le milieu, puis centrifuger les cellules de 5% de FBS et exécutez les étapes 1.8 à 1.10 avec un milieu frais et de fiole. </li></ol> 2. Expansion des AgsNSC <ol><li> Deux jours (~ 48 heures) après la décongélation et l&#39;ensemencement des cellules, un remplacement plein milieu devrait être effectuée en utilisant 20 ml de milieu Expansion agsNSC plus un pic 40 uL de rh FGF-base. </li><li> Flacons de Spike avec 40 uL de rh FGF-base sur l&#39;inoculation jour suivant. Les cellules seront prêtes à trypsiniser quand ils ont atteint la confluence de 75-80% par la troisième ou quatrième jour après l&#39;inoculation. La culture des cellules souches indifférenciées pendant plus de 4 jours après l&#39;inoculation n&#39;est pas recommandée car incubation plus longue permettra aux cellules commencent à se différencier pour les neurones et les neurones peuvent être blessés par trypsinisation pendant l&#39;étape 3. Le FGF-RH de base peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine et toujours maintenir l&#39;activité. Le FGF-rh base peut également passer par un gel des supplémentaires / dégel à -20 ° C si plus de temps est nécessaire. </li></ol> 3. Trypsinisation des cellules <ol><li> agsNSC doivent être repiquées 3 à 4 jours après l&#39;inoculation. Préparer un flacon de poly-L-ornithine enduit entre 24 heures et une semaine avant repiquage si l&#39;agsNSC sera élargi à nouveau. </li><li> Aspirer lemoyenne du récipient de culture. Ajouter 2,5 ml de 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) à la cuve pour chaque 75 cm 2 de surface. Agiter doucement pour s&#39;assurer que toutes les cellules sont recouvertes avec la trypsine / EDTA. Les cellules commencent normalement à se détacher de la surface dans les 60 secondes, en fonction de la confluence des cellules. Ne pas trop trypsiniser, car cela pourrait endommager les cellules. Tapotant doucement le récipient de culture de plusieurs côtés encouragera le détachement. </li><li> Une fois que les cellules se détachent, ajouter 10 ml de milieu de base + 5% agsNSC FBS dans le ballon. Remuer doucement pour assurer l&#39;ensemble de la solution de trypsine est neutralisée. En utilisant des techniques de laboratoire d&#39;asepsie, une pipette les cellules dans un tube à centrifuger stérile contenant 10 ml de FBS agsNSC basale moyenne 5%. Répétez en lavant le flacon à nouveau avec un supplément de 10 ml de milieu de base + agsNSC 5% de FBS et de combiner avec le premier lavage. </li><li> Centrifuger les cellules à 150 xg pendant 6 minutes comme décrit ci-dessus. Après centrifugation, les cellules doivent former un nettoyage granulés en vrac. Aspirer la trypsine neutralisée et moyennes du tube de centrifugation et de remettre en suspension les cellules dans 10 ml granulés (par T-75 flacon) de pré-chauffé moyen basal agsNSC + 5% de FBS par un léger pipetage haut et en bas 2X avec une pipette de 10 ml. Effectuer une numération cellulaire comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. Calcul standard pour le placage des cellules <ol><li> En utilisant une technique aseptique, tourbillon de la suspension cellulaire et le transfert 15 ul de la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Ajouter 15 ul de 0,4% au bleu Trypan. Mélanger doucement et une charge de 10 uL de suspension cellulaire à chacune des chambres d&#39;un hématimètre propres comme une ligne lumineuse Comptage Chambre (catalogue # 1490: Hausser scientifique, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Comptez un minimum de 4 quadrants sur l&#39;hématimètre. Les cellules bleues qui sont positifs pour Bleu Trypan sont morts et ne doivent pas être comptés. Pour nombre de cellules précises, le nombre optimal de cellules par quadrant devrait être de 25 à 75 cellules. </li><li> Après comptage des cellules, de calculer la moyenne des quatre quadrants. Multipliez le nombre moyen de cellules par 10 000 et par le facteur de dilution (2 si vous utilisez les volumes recommandés) pour déterminer le nombre de cellules par mL. Notez que si la viabilité pourcentage total est inférieur à 92% il peut y avoir un certain nombre de causes. Une des raisons de faible viabilité peut être plus trypsinisation, avant neutralisation par la trypsine de FBS. Une autre raison peut être que la concentration de sérum (FBS) à la trypsine est trop faible et les cellules continuent à être traitées à la trypsine. Troisièmement, les cellules peuvent avoir été trop confluentes, causant des cellules souches à se différencier en raison de contact cellule-cellule, conduisant à des blessures lors de trypsinisation. Si cette méthode est suivie de près un rendement de 3 ou plus doublements on peut s&#39;attendre, ce qui donne une population de&gt; 4.000.000 cellules à partir d&#39;un nombre initial de 500 000 ~. </li></ol> 5. L&#39;inoculation d&#39;un autre flacon Expansion <ol><li> Pour déterminer le nombre total de cellules nécessaires pour inoculer un navire, il faut multiplier la densité de semis souhaitée (6600 cellules par cm 2 ou 500 000 cellules par flacon T-75) par la surface (en cm 2) du navire à être inoculés. Si l&#39;inoculation plus d&#39;un navire de multiplier le nombre de cellules par navire par le nombre total de navires. Pour déterminer le volume (ml) de suspension de cellules nécessaires pour inoculer chaque navire, divisez le nombre de cellules nécessaires pour inoculer un navire par le nombre de cellules viables / ml dans la suspension cellulaire. Si l&#39;inoculation plus d&#39;un navire de calculer le volume total de suspension cellulaire nécessaire en multipliant le volume nécessaire pour un navire par le nombre total de navires de se faire vacciner. </li><li> Centrifuger le volume souhaité de cellules dans un milieu basal agsNSC + 5% de FBS, laissant un lâche granulés. Normalement 500.000 cellules sont portées à un volume total de 25 ml dans le milieu basal agsNSC 5% de FBS, comme décrit précédemment. Aspirer le liquide et re-suspendre le culot dans lâches 10 ml de milieu Expansion agsNSC Cette étape de centrifugation supplémentaire est nécessaire pour éliminer FBS avant l&#39;inoculation. Ajouter 10 ml de pré-chauffé moyen d&#39;extension agsNSC le ballon T-75. Ajouter les 10 ml de suspension cellulaire en suspension dans le flacon T-75, puis ajouter 40 ul de rh FGF-base dans le ballon. Considérons que la trypsination et l&#39;inoculation devrait pas prendre plus de 1,5 heures au moment de décider le nombre maximum de flacons de travailler avec à tout moment. On devrait aussi avoir assez de journalistes pour les changements de supports complète si vous utilisez des flacons nombreux. </li><li> Secouez doucement le ballon de côté à l&#39;autre afin de répartir uniformément les cellules et les vaisseaux lieu de culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, comme décrit précédemment. </li></ol> 6. Dilution des cellules pour l&#39;inoculation des plaques Eh bien pour la différenciation <ol><li> Toute multi-format et pourrait être utilisé, mais l&#39;inoculation dans BD Biocoat poly-L-lysine revêtement des plaques de 96 puits est described ici. Déterminer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour votre expérience en multipliant le nombre de puits pour être inoculé par 0,2 ml par puits d&#39;une 96 plaque multi-puits et ajouter environ 10% pour couvrir toute perte de volume lors de l&#39;inoculation. Calculer la dilution à une densité cellulaire de 75 000 cellules / mL. Déterminer le montant de FBS à être ajouté au milieu de différenciation pour obtenir une concentration finale de 2% de FBS (tableau 1). Mélanger le FBS et milieu de différenciation. Mélanger délicatement les cellules avec le volume calculé de milieu de différenciation avec du FBS. (Note: Lors de la centrifugation les cellules basales sont en moyenne agsNSC + 5% SVF Bien FBS protège les cellules pendant la centrifugation et facilite l&#39;adhésion des cellules inhibe FBS differention dilution à 2% de FBS permettra à l&#39;adhérence des cellules à la surface multi-puits... Le FBS 2% est ensuite diluée pour promouvoir la différenciation. Insulin-transferrine-Sélénium (ITS-e) est également inclus dans le milieu de différenciation pour promouvoir la différenciation. </li><li> Dans une enceinte de biosécurité, de distribuer 200 uL de suspension cellulaire diluée à partir d&#39;un réservoir Combitip stérile pour chaque puits d&#39;une poly-L-lysine plaque de 96 puits revêtus à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canaux et des conseils grand orifice. Incuber les plaques pendant 1,5-2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Après que les cellules ont attaché, après environ 90 à 120 minutes, retirez soigneusement de 50% (100 ul pour plaques 96 puits) du milieu de chaque puits en utilisant de grands embouts de pipette orifice. Replacez soigneusement le volume enlevé avec milieu de différenciation chaude agsNSC, là encore en utilisant de grands embouts de pipette orifice. (Utilisation des conseils orifice normalisé peut blesser les cellules). </li><li> Deux jours après l&#39;inoculation (~ 48 heures), effectuer un changement de milieu à 50% en utilisant milieu de différenciation agsNSC et grands embouts de pipette orifice. </li></ol> 7. Entretien des neurones <ol><li> Préparer le milieu d&#39;entretien neuronale utilisant NeuraLife, la glutamine et B27 selon les instructions. Milieu d&#39;entretien neuronale devrait être préparée par semaine. </li><li> Deux jours après le dernier changement de différenciation agsNSC moyen, normalement Jour 4 après l&#39;inoculation, effectuer un remplacement moyen de 50% en utilisant un milieu d&#39;entretien neuronale. </li><li> Continuer à effectuer des remplacements moyenne de 50% en utilisant un milieu d&#39;entretien neuronale tous les 2 à 3 jours. Processus neuronaux devrait apparaître dans quelques jours du passage à un milieu d&#39;entretien neuronale. Les cellules doivent être utilisées dans les 3 semaines d&#39;être transférés à un milieu d&#39;entretien neuronale. Les neurones peuvent être identifiés en utilisant un nombre de marqueurs neuronaux disponibles commercialement. Les astrocytes sera également toujours être observées. </li><li> Populations Culture expriment généralement un ratio supérieur à 40% des neurones au nombre total de cellules. L&#39;utilisation des médias d&#39;entretien des neurones autres que NeuraLife peut fournir des cellules inférieures qui ne regardent pas morphologiquement matures et peuvent ne pas survivre aussi longtemps dans la culture. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: L&#39;Arctique spermophile cellules souches neurales adultes continuera à doubler tous les 24 heures pendant 3 à 5 jours pour au moins deux passages où ensemencées à 500,000-600,000 flacon cells/75mm. Ces cellules vont différencier facilement avec la suppression de basicFGF et B27 et la présence de FBS 1-2% et 1% insuline / Transferrine / sélénium, et deviendra TUJ1 (Covance) neurones positifs dans 14-21 jours (voir Figure 2). Le ratio des neurones aux cellules totale sera comprise entre 40-60%, dépendant de l&#39;âge de la culture (figure 3). Les neurones peuvent être utilisés pour l&#39;expérimentation de 12 jours après l&#39;ensemencement à travers au moins 21 jours après le semis. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Microphotographie d&#39;AGS pour adultes hippocampique cellules souches neurales. Photomicrographie phase de l&#39;AGS pour adultes hippocampique cellules souches neurales suivante 3 jours de croissance dans les médias agsNSC basale en poly-L-ornithine flacons enduits. Doubler survient environ toutes les 24 heures. Photo à un grossissement de 100x. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Fluorescent micrographie différenciés AGS adulte hippocampique cellules souches neurales Cellules souches neurales AGS ont été soumis à des médias de différenciation pour 4 jours, puis maintenue dans Neuralife pour 17 jours de plus avant de fixer. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et les neurones identifiés à l&#39;aide TUJ1 anticorps primaire (Covance) et Alexa Fluor 568 anticorps secondaire (vert) d&#39;Invitrogen. Colorant Hoechst 33343 a été ajouté pour colorer tous les noyaux (bleu). Le nombre de cellules, le nombre de neurones et le ratio de neurone ont été déterminés en utilisant le logiciel neurites et l&#39;instrument de Arrayscan Cellomics. Cette photo représente environ 57% des neurones. Grossissement 10X <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Nombres de neurones et des cellules Ratio Neuron AGS différenciés souches neurales moins troisles âges de la culture Cellules souches neurales AGS ont été soumis à des médias de différenciation pour 4 jours, puis maintenue dans Neuralife pour les jours 12, 15 et 17 avant la fixation. Les cellules ont été fixées et les neurones identifiés avec TUJ1 anticorps primaire (Covance). Colorant Hoechst a été ajouté pour colorer tous les noyaux de cellules pour l&#39;identification totale. Le nombre de cellules, le nombre de neurones et le ratio de neurone pour cent ont été déterminés en utilisant le logiciel neurites et l&#39;instrument de Arrayscan Cellomics. Les valeurs représentent moyenne de 15 puits par condition + SD. Exemple de tableau des calculs 1. Utilisé dans repiquage et le semis <ol><li> Utiliser 700 000 cellules / ml de suspension cellulaire </li><li> En utilisant une densité cellulaire de 75 000 cellules / ml ou 15 000 cellules par puits de 0,2 ml de volume dans chaque puits. </li><li> Inoculation 96 puits à raison de 0,2 ml par puits = 19,2 mL ou désiré volume final 21 ml. </li><li> (Final Volume x concentration finale) ÷ concentration initiale = volume initial (21 ml x 75 000 cellules / mL) ÷ 700 000 = 2,25 mL </li><li> Volume de FBS en suspension de cellules. = 2,25 mL 2,25 mL x 0,05 = 0,1125 ml </li><li> Volume de FBS nécessaire dans 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml </li><li> Volume de FBS à ajouter à milieu de différenciation = 0,42 ml - 0,1125 0,3075 ml = ml </li><li> Le volume de milieu de différenciation = 21 ml - 2,25 ml de suspension cellulaire - 0,3075 ml 5% de FBS = 18,44 mL. </li><li> Combinez 18,44 milieu de différenciation mL avec 0.308 FBS ml et ajouter 2,25 ml de suspension cellulaire. </li></ol>

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	<li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+avoidance+in+a+mammal:+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator.">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li><li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia.">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li><li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel.">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li><li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel.">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li><li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arctic+ground+squirrel+(Spermophilus+parryii)+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1/2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss.">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li><li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+progenitor+cells:+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain.">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li><li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells.">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons.">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li><li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells.">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li></ol>

Le juge Kelleher-Andersson est le fondateur de Neuronascent et est l&#39;inventeur sur les applications du sol arctique de brevets d&#39;écureuil. Neuronascent reçoit des redevances sur la vente d&#39;AGS médias et les cellules souches. RC McGee est employé par Lifeline, Inc, qui distribue des cellules médias et AGS souches neurales.

AGS cellules adultes souches neurales sont robustes et peuvent être étendues pour de nombreux passages qui en fait une excellente source de cellules souches neurales pour l&#39;étude de la base neurale propriétés de cellules souches. Le taux d&#39;expansion est d&#39;environ un doublement tous les vingt-quatre heures, mais ces cellules doivent être repiquées avant d&#39;atteindre la confluence, car le contact entre les cellules seront privilégier la différenciation d&#39;astrocytes. Contactez-médiatisée de di...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>agsNSC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>FC-0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agsNSC Expansion kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0008</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>agsNSC differentiation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0009</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuraLife maintenance media kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0012</td>
<td>Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td><a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDBioscience</td>
<td>356516</td>
<td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-707-141</td>
<td>Avoids neuronal cell damage when pippetting. <a href="http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

growth and differentiation of adult hippocampal arctic ground squirrel neural stem cells

Les spermophiles arctiques (Urocitellus parryii, AGS) sont uniques dans leur capacité à hiberner avec une température corporelle de près ou en dessous de zéro 1. Ces animaux aussi résister à une lésion ischémique du cerveau in vivo 2,3 et de l&#39;oxygène du glucose in vitro, la privation 4,5. Ces qualités uniques ont donné l&#39;impulsion à isoler les neurones AGS afin d&#39;examiner les caractéristiques inhérentes neuronales qui pourraient rendre compte de la capacité des neurones à résister à l&#39;AGS blessures et la mort cellulaire provoquée par l&#39;ischémie et les températures extrêmement froides. Identifier ou protéines cibles de gènes qui permettent pour les propriétés distinctives de ces cellules pourrait aider à la découverte de thérapies efficaces pour un certain nombre d&#39;indications ischémiques et pour l&#39;étude de la tolérance au froid. Adulte AGS hippocampe contient des cellules souches neurales qui continuent à proliférer, ce qui permet une extension facile de ces cellules souches en culture. Nous décrivons ici les méthodes par lesquelles les chercheurs peuvent utiliser ces cellules souches et les neurones différenciés pour n&#39;importe quel nombre de buts. En suivant de près les étapes les cellules souches neurales AGS peut être étendu grâce à deux passages ou plus, puis différenciées pour une culture riche en TUJ1 neurones positifs (~ 50%) sans utiliser des produits chimiques toxiques afin de minimiser le nombre de cellules en division. L&#39;ischémie induit neurogenèse 6 et neurogenèse qui procède par MEK / ERK et voies de survie PI3K/Akt de signalisation contribue à la résistance d&#39;ischémie in vivo et in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., En préparation). Une caractérisation plus poussée de ces cellules uniques neurones peuvent avancer sur plusieurs fronts, en utilisant tout ou partie de ces méthodes.

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Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Les cellules souches neurales ont été préparés à partir de l&#39;hippocampe d&#39;adultes non-hibernation yearlings spermophiles arctiques (AGS). Ces cellules souches neurales peuvent être complétés par de nombreux passages, différenciés et entretenu comme un neurone près 50:50 à la culture gliales.

Croissance et différenciation des cellules adultes hippocampe Arctic écureuil souches neurales au sol

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vues.  University of Alaska at Fairbanks. Les cellules souches neurales ont été préparés à partir de l'hippocampe d'adultes non-hibernation yearlings spermophiles arctiques (AGS). Ces cellules souches neurales peuvent être complétés par de nombreux passages, différenciés et entretenu comme un neurone près 50:50 à la culture gliales.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neurosciences

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolement et culture des adultes cellules souches neurales de la Subcallosal Zone Souris

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Régulation spécifique du circuit d'analyse des cellules neuronales neuronales hippocampales adultes

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

Analyse de la différenciation et de la maturation de criblage à haute teneur de cultures de cellules souches neurales fœtales et adultes dérivées de cellules souches oligodendrocytes

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...