Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materyal Komutanlığı hibe # 05178001 ve Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü NS041069-06 tarafından desteklenmiştir. Biz Joel Vonnahme protokol yararlı yorumlar için teşekkür ederim.

1. AGS Nöral Kök Hücre ve Medya Hazırlık <ol><li> Bir şekilde izole nöral kök hücreler, daha önce açıklanan 9 Yetişkin hipokampal Arctic zemin sincap (AGS) Kriyoprezerve şişeleri ticari olarak elde edilebilir. Hücreler, hücreleri Kriyoprezerve bir durumda kalmasını sağlamak için kuru buz içeren yalıtılmış paketleri gecede sevk edilmektedir. Bütünlüğünü korumak için, açmak -150 daha düşük hemen alınması ve depolanması ile hücreleri ° C, ya da bir sıvı nitrojen Dewar buhar fazında. </li><li> AgsNSC Bazal Orta hazırlayın +% 5 FBS 95 ml agsNSC Bazal Orta 5 mL FBS (LS-1012) ekleyerek, </li><li> 500 mcL B-27 Supplement (Invitrogen) 50 ml agsNSC Bazal Orta ekleyerek agsNSC Genleşme Orta hazırlayın. Kullanana kadar 1mL alikotları ve -20 ° C&#39;de saklayın B27 kalan bölün. </li><li> 25 ml Sıcak agsNSC Bazal Orta +% 5 - 37 ° C su banyosunda agsNSC Genişleme Orta FBS ve 20 ml. </li><li> Poli-L-ornitin ile genişletilmesi için kullanılan Coat matara <ol><li> Poli-L-ornitin (10 mg / ml) çalışan bir çözüm çözülme. ° C ile bir kez çözdürülmelidir bir ay kadar 2-8 arasında çözüm saklayın. </li><li> 8 mL Poli-L-Ornithine çalışma çözeltisi ekleyin ve bir Bacalı T-75 şişesi, balonun tüm kültür yüzeyi üzerinde eşit çözüm dağıtmak. (Kullanım 0.5 kullanılmış olabilecek diğer kültür gemiler için çözüm çalışma miktarını ayarlayın - 10 cm 2 kültür yüzey başına 1,0 mL Poli-L-Ornithine çözüm) </li><li> 37 ° C&#39;de en az 24 saatlik bir matara inkübe edin. (Poli-L-Ornithine kaplı kültür damarlarının eklendi CO 2 olmadan bir kuluçka inkübasyon için tercih edilir.) Kaplamalı şişeler inkübatör iki hafta kadar saklanabilir. </li><li> Kullanmadan önce, şişeden Poli-L-Ornithine çalışma çözüm aspirat ve iki kez steril doku kültürü dereceli su ile yıkayın. Kullanmadan önce şişeyi neredeyse kuru hale gelene kadar sıvı aspire edin. </li></ol></li><li> Dewar bir şişe çıkarın ve flakon kapağı sıkıca kapatılmış olup olmadığını kontrol edin. Flakon neredeyse tamamen çözülene kadar yaklaşık 60-90 saniye veya 37 ° C su banyosunda bırakarak flakon flakon alt yarısında üst tutun; küçük bir miktar buz hala görünür olmalıdır. Potansiyel kontaminasyonu önlemek için, suyun flakon kapağı dışarı tutmak. Çözülme üzerinden yapmayın, bunu hücrelere zarar verebilir. </li><li> % 70 etanol veya isopropanol flakon dış Sprey, daha sonra biyolojik güvenlik kabini flakon. Kontaminasyon veya sıçramak önlemek için dikkatli bir şekilde kapağı çıkarın. </li><li> Steril bir pipet kullanarak 1 mL agsNSC Bazal medya +% 5 FBS ekleyerek yavaşça flakon hücrelerin yeniden askıya. 25 ml sıcak agsNSC Bazal Orta yeniden askıya hücreleri Transfer +% 5 FBS 50 ml santrifüj tüpüne. </li><li> Kriyo-flakon sulandırılmış hücre süspansiyonu ile bir kez durulayın. 6 dakika boyunca 150 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. En iyi sonuç için, her bir santrifüj tipi için hızı hesaplar. </li><li> Hücreleri aşağı dönerken, kuru poli-L-ornitin kaplı T-75 balonuna 10 ml agsNSC Genişleme Orta ve rh FGF-temel (40ng/mL) 40 mcL ekleyin. Santrifüj sonrasında, pelet aspire özen Süpernatant sıvı aspire. 10 ml agsNSC Genişleme Orta hücrelerin yeniden askıya aldı. AgsNSC Genişleme Orta yeniden askıya hücreler, T-75 balonuna ortama aktarın. </li><li> Kültür gemi yan-yan damar içindeki hücreler eşit olarak dağıtmak için yavaşça sallayın. </li><li> 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör Yeri numaralı seribaşı kültür gemi. Hücreler balon eklemek ve süreçleri tohumlama iki saat içinde oluşmaya başlar. Kayan hücreleri kalır ve orta içinde tıkıştırılmış, sonra% 5 FBS hücreler santrifüj ve taze orta ve balon adımları 1,8-1,10 çalıştırmak. </li></ol> 2. AgsNSC, genişletilmesi <ol><li> Çözülme ve tohum hücreleri iki gün (48 saat) sonra, tam orta yerine 20 mL agsNSC Genişleme Orta artı rh FGF-temel bir mcL 40 başak kullanarak yapılmalıdır. </li><li> 40 gün aşağıdaki aşılama rh FGF-bazik mcL Spike şişeler. Hücreler, üçüncü veya dördüncü gün sonra aşılama ile% 75-80 izdiham ulaştığınızda trypsinize hazır olacaktır. 4 gün sonra aşılama daha uzun süre kültür farklılaşmamış kök hücreleri uzun kuluçka hücreleri 3. adımında trypsinization tarafından yaralı olabilir, nöronlarda ve nöron ayırt başlamak için izin verecek, çünkü tavsiye edilmez. Rh FGF-temel bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de saklanır ve hala faaliyet sürdürmek olabilir. Daha fazla zamana ihtiyaç duyulması halinde rh FGF-temel -20 ° C&#39;de bir ek donma / çözülme de gidebilirsiniz. </li></ol> 3. Hücre, Trypsinization <ol><li> agsNSC aşılama 3 ila 4 gün sonra geçişli olmalıdır. AgsNSC tekrar genişletilmiş olacak Pasajlanması önce 24 saat ve bir hafta arasında bir poli-L-ornitin kaplı şişesi hazırlayın. </li><li> Aspirekültür geminin orta. 2.5 mL% 0.05% Trypsin/0.02 yüzey alanının her 75 cm 2 geminin EDTA (CM-0017). Tüm hücreleri sağlamak için hafifçe Swirl tripsin / EDTA ile kaplanmıştır. Hücreler normal hücrelerin birleştiği bağlı olarak, 60 saniye içinde yüzeyden ayırmak için başlar. Trypsinize üzerinde etmeyin, bunu hücrelere zarar verir. Hafifçe birkaç taraftan kültür damarı dokunarak dekolmanı teşvik edecektir. </li><li> Hücrelerin müstakil hale sonra, 10 ml agsNSC Bazal Orta eklemek +% 5 FBS balon. Tripsin çözüm sağlamak için yavaşça girdap nötralize edilir. Aseptik laboratuvar teknikleri kullanarak, agsNSC Bazal orta +5% FBS 10 ml içeren steril bir santrifüj tüpü içine hücreleri pipetle. AgsNSC Bazal Orta ek olarak 10 mL şişeyi tekrar yıkanarak +% 5 FBS tekrarlayın ve ilk yıkamada ile birleşir. </li><li> 6 dakika boyunca 150 xg&#39;de Santrifüj hücreleri yukarıda açıklandığı gibi. Santrifüj sonra, hücreler temiz bir gevşek pelet oluşturmalıdır. Hafifçe yukarı aşağı pipetleme ve 10 ml pipet ile 2X santrifüj tüpüne nötralize tripsin ve orta aspire edin ve önceden ısıtılmış agsNSC Bazal Orta 10 ml yeniden askıya hücre pelletini (kişi başına T-75 balon) +% 5 FBS. Aşağıda açıklandığı gibi bir hücre sayımı gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hücre Kaplama için Standart Hesaplama <ol><li> Aseptik teknik kullanarak, girdap hücre süspansiyonu ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer hücre süspansiyonu 15 mcL. % 0.4 Tripan Blue 15 mcL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve hücre süspansiyon Odası (katalog # 1490: Hausser Bilimsel, Sayma Parlak Hattı gibi temiz bir hemasitometre odalarının her biri için 10 mcL <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">yük</a> http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm) . </li><li> Hemasitometre 4 kadranın en az güvenin. Tripan Blue pozitif mavi hücreler ölü ve sayılmamalıdır. Doğru hücre sayımı için, optimum sayıda kadran başına hücre 25-75 hücreleri olmalıdır. </li><li> Hücrelerinin sayımı sonra, ortalama 4 kadranın hesaplar. Hücre sayısı ortalama 10.000 ve seyreltme faktörü ile çarpın (2 tavsiye edilen hacim kullanarak) mL başına hücre sayısını belirlemek için. Toplam yüzdesini canlılığı% 92 den az olması durumunda bir takım nedenleri olabileceğini unutmayın. Bir nedeni düşük canlılığı FBS ile nötralizasyon tripsin önce, trypsinization üzerinde olabilir. Tripsin serum (FBS) konsantrasyonu çok düşük olduğu ve hücrelerin tripsinize olmaya devam başka bir nedeni olabilir. Üçüncü olarak, hücreler, kök hücreler, hücre-hücre teması nedeniyle ayırt trypsinization sırasında yaralanmaya yol açan neden çok konfluent olabilir. Bu yöntem yakından takip ise 3 veya daha fazla çiftlenmeler verim&gt; bir başlangıç ​​sayısı 500.000 ~ 4.000.000 hücrelerinin bir nüfus veren, beklenen olabilir. </li></ol> 5. Başka bir Genişleme Flask Aşılanması <ol><li> Bir gemi aşılamak için gerekli olan hücrelerin toplam sayısını belirlemek için, inoküle damar yüzey alanı (cm 2) (cm 2 başına 6.600 hücreleri ya da T-75 şişesi ortalama 500.000 hücreleri) tarafından istenen ekim yoğunluğu çarpın . Birden fazla gemi aşılama gemilerin toplam sayısı gemi başına bir hücre sayısını çarpın. Her iki tekne de aşılamak için gerekli hücre süspansiyonu hacmi (ml) belirlemek için, canlı hücre / hücre süspansiyonu mL sayısına göre bir gemi aşılamak için gerekli hücrelerin sayısı bölün. Birden fazla gemi aşılama hücre süspansiyonu inoküle edilecek gemilerin toplam sayısı bir gemi için gerekli olan hacim çarpılarak gerekli toplam hacmi hesaplarsanız. </li><li> Gevşek bir pelet bırakarak agsNSC Bazal Orta istenen hücre hacmi +% 5 FBS santrifüjleyin. Normalde 500.000 hücreleri +5% FBS daha önce açıklandığı gibi agsNSC Bazal Orta toplam hacmi 25 mL getirilir. Sıvı aspire ve 10 ml Bu ekstra santrifüj adım aşılamadan önce FBS kaldırmak için gerekli agsNSC Genişleme Orta gevşek pelet yeniden askıya. T-75 balona 10 ml önceden ısıtılmış agsNSC Genişleme Orta ekleyin. T-75 balona yeniden süspanse hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin, daha sonra rh erlene FGF-temel 40 mcL ekleyin. Herhangi bir zamanda çalışmak için maksimum sayıda şişe karar verirken trypsinization ve aşılama 1.5 saat daha uzun sürer gerektiğini düşünün. Bir de sayısız şişeler kullanıyorsanız, tam bir medya değişiklikler için yeterli medya olmalıdır. </li><li> Yavaşça şişeyi yan yana gelen hücreler eşit olarak dağıtmak için rock ve daha önce açıklandığı gibi 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör, kültür damarları. </li></ol> 6. Farklılaşma için Well plakalar Aşılama için Hücreler seyreltilmesi <ol><li> Herhangi bir çok iyi formatı kullanılır, ancak BD Biocoat Poli-L-lisin kaplı 96 kuyucuğu inokülasyon des olabilirburada açıklanan şekilde değiştirin. 96 çok iyi plaka için ortalama 0.2 ml inoküle kuyu sayısı çarpılarak denemeniz için gerekli hücre süspansiyonu hacmi belirlemek ve aşılama esnasında herhangi bir hacim kaybı karşılamak için yaklaşık% 10 ekleyin. 75.000 hücre / mL &#39;lik bir hücre yoğunluğu seyreltme hesaplayın. % 2 FBS bir final konsantrasyonu (Tablo 1) elde etmek için Farklılaşma Orta eklenecek FBS miktarını belirlemek. FBS ve Farklılaşma Orta karıştırın. Hücreler Farklılaşma Orta FBS ile hesaplanan hacmi ile dikkatlice karıştırın. (Not: santrifüj sırasında hücreler agsNSC Bazal Orta +% 5 FBS FBS santrifüj sırasında hücreleri korur ve hücre adezyon FBS inhibe differention kolaylaştırır iken% 2 FBS Sulandırma hücreleri çok iyi bir yüzeye yapışma sağlayacaktır. 2% FBS farklılaşma teşvik için daha fazla seyreltilir. İnsülin Transferrin-Selenyum (ITS-e) da farklılaşma tanıtmak için Farklılaşma Orta yer almaktadır. </li><li> Biyogüvenlik kabini, her iyi, çok kanallı pipet ve büyük orifis ipuçları kullanarak Poli-L-lizin kaplı 96-plaka seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir combitip rezervuar 200 uL dağıtmak. 37 1.5-2 saat plakaları ° C&#39;de,% 5 CO 2. Hücreleri, bağlı, yaklaşık 90-120 dakika sonra, her bir kuyunun kullanarak büyük orifis pipet uçları dikkatlice orta (96 kuyucuğu için 100 mcL)% 50 çıkarmak sonra. Dikkatlice tekrar büyük orifis pipet uçları kullanarak, sıcak agsNSC Farklılaşma Orta ile kaldırıldı hacim değiştirin. (Standart orifis ipuçları Kullanım hücrelere zarar olabilir). </li><li> İki gün sonra aşılama (~ 48 saat),% 50 orta değişikliği agsNSC Farklılaşma Orta ve büyük orifis pipet uçları kullanarak gerçekleştirin. </li></ol> 7. Nöronların Bakım <ol><li> Nöronal Bakım Orta talimatları başına NeuraLife, glutamin ve B27 kullanarak hazırlayın. Nöronal Bakım Orta haftalık hazırlanmalıdır. </li><li> Son agsNSC Farklılaşma Orta değişikliği, normalde 4. Gün yazılan aşılama iki gün sonra,% 50 orta değiştirme Nöronal Bakım Orta kullanarak gerçekleştirin. </li><li> Her 2 ila 3 gün Nöronal Bakım Orta kullanarak% 50 orta değiştirmeleri gerçekleştirmeye devam etmektedir. Nöronal süreçleri Nöronal Bakım Orta değişen bir kaç gün içinde görünmelidir. Hücreleri Nöronal Bakım Medium aktarılıyor 3 hafta içinde kullanılmalıdır. Nöronlar, piyasada bulunan nöronal belirteçlerin bir numarayı kullanarak tespit edilebilir. Astrositler da her zaman görülecektir. </li><li> Kültür popülasyonları genellikle, toplam hücre sayısı nöronların% 40 den daha büyük bir oranı ifade eder. NeuraLife başka nöron bakım medya kullanımı morfolojik olgun görünmüyor ve kültür sürece hayatta olmayabilir alt hücreleri sağlayabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Arktik kara sincap yetişkin sinir kök hücreleri 500.000-600.000 cells/75mm şişesi numaralı seribaşı için 3 ile 5 gün boyunca her 24 saatte en az iki geçit çift devam edecektir. Bu hücreler basicFGF ve B27 kaldırma ve% 1-2 FBS varlığı ve% 1 İnsülin / Transferrin / Selenyum ile kolayca ayırt edecek ve 14-21 gün içinde TUJ1 (Covance) pozitif nöronların (bkz. Şekil 2) olacak. Toplam hücreleri nöronların oranı% 40-60, kültür yaşına bağlıdır (Şekil 3) arasında değişmektedir. Nöronlar-tohumlama sonrası en az 21 gün ile 12 gün sonrası tohumlama deneyleri için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler yüzey elde. Poli-L-Ornithine kaplı şişelerde agsNSC bazal medyada büyüme 3 gün sonra AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Faz yüzey elde. Katlama yaklaşık her 24 saatte bir gerçekleşir. 100X büyütme Foto. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Farklılaştırılmış AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Floresan mikrografı AGS nöral kök hücreler, sonra sabitleme için önce 17 gün daha Neuralife muhafaza 4 gün, farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreler,% 4 paraformaldehid ve Invitrogen TUJ1 birincil antikor (Covance) ve Alexa Fluor 568 sekonder antikoru (yeşil) kullanarak tespit nöronlar ile tespit edildi. Hoechst boyası 33343 tüm çekirdeklerin (mavi) leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Bu fotoğraf yaklaşık% 57 nöronlar temsil eder. 10X büyütme <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Nöron numaraları ve üç Farklılaştırılmış AGS nöral kök hücrelerin Nöron Oranıkültür yaşları AGS nöral kök hücreler, 12, 15 ve 17 gün önce tespit Neuralife tutulan, daha sonra 4 gün boyunca farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreleri sabit ve nöronlar TUJ1 birincil antikor (Covance) ile tespit edilmiştir. Hoechst boyası, toplam hücre tanımlaması için tüm çekirdekleri leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve yüzde nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Değerler ortalama 15 kuyu durumu + SD ortalama temsil eder. Tablo 1: Pasajlanması ve tohumlamada kullanılan Örnek hesaplamalar <ol><li> 700.000 hücre / ml hücre süspansiyonu </li><li> 75.000 hücre / mL ya da 15.000 hücre hücre yoğunluğu başına her kuyuda 0.2 mL hacimde kullanma. </li><li> Iyi = 19.2 mL veya istenilen son hacim 21 ml başına 0.2 ml 96 kuyu aşılamak. </li><li> ÷ İlk Konsantrasyon (Final Konsantrasyon x Final Cilt) = Başlangıç ​​Cilt (21 ml x 75.000 hücre / ml) ÷ 700.000 = 2.25 mL </li><li> Cilt hücre süspansiyonu FBS. 2.25 ml = 2.25 ml x 0.05 = 0,1125 ml </li><li> FBS hacmi, 21 ml = 21 ml x 0.02 = 0.42 mL gerekli </li><li> FBS Farklılaşma Orta eklemek hacmi = 0.42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 ml </li><li> Hacmi 2.25 ml hücre süspansiyonu - 0,3075 ml% 5 FBS = 18,44 mL Farklılaşma Orta = 21 mL. </li><li> 18,44 mL Farklılaşma Orta 0,308 mL FBS ile birleştirin ve 2.25 ml hücre süspansiyonu ekleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+avoidance+in+a+mammal:+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator.">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li><li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia.">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li><li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel.">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li><li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel.">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li><li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arctic+ground+squirrel+(Spermophilus+parryii)+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1/2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss.">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li><li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+progenitor+cells:+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain.">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li><li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells.">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons.">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li><li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells.">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li></ol>

JA Kelleher-Andersson Neuronascent kurucusu ve Arktik kara sincap patent başvuruları mucididir. Neuronascent AGS medya ve kök hücreleri satışı üzerinde telif alır. RC McGee, medya ve AGS sinir kök hücrelerinin dağıtır Lifeline, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

AGS yetişkin sinir kök hücreleri sağlam ve nöral kök hücrelerin çalışması için temel nöral kök hücre özelliklerini mükemmel bir kaynak haline çok sayıda geçişleri için açılabilir. Genişleme oranını yaklaşık iki katına biri her yirmi dört saatte, ancak hücreleri arasındaki temas astrositler farklılaşma lehine olacaktır, çünkü bu hücreler ulaşan izdiham önce geçişli olmalıdır. Bu nedenle, İletişim-aracılı farklılaşma farklılaşma trypsinization ve geçiş öncesinde ba?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>agsNSC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>FC-0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agsNSC Expansion kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0008</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>agsNSC differentiation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0009</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuraLife maintenance media kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0012</td>
<td>Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td><a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDBioscience</td>
<td>356516</td>
<td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-707-141</td>
<td>Avoids neuronal cell damage when pippetting. <a href="http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

growth and differentiation of adult hippocampal arctic ground squirrel neural stem cells

Arctic zemin sincap (Urocitellus parryii, AGS) dondurulması 1 yakınında ya da altında bir çekirdek vücut ısısı ile hibernate yeteneği benzersiz. Bu hayvanlar aynı zamanda, in vivo 2,3 ve oksijen-glikoz in vitro 4,5 mahrum beyin iskemik yaralanmalara karşı. Bu benzersiz nitelikleri, yaralanma ve iskeminin neden olduğu hücre ölümü ve son derece soğuk havalarda karşı AGS nöronların kapasitesi hesabı doğasında nöronal özellikleri incelemek AGS nöronlar izole etmek için bir ivme sağladı. Proteinler ya da bu hücrelerin ayırt edici özelliklerini sağlayan gen hedefleri belirleme iskemik endikasyon ve soğuk hoşgörü çalışması için bir dizi etkili tedavilerin keşif yardımcı olabilir. Yetişkin AGS hipokampus, bu kök hücrelerin kültür kolay genişleme için izin, yayılmaya devam etmektedir nöral kök hücreler içerir. Biz burada araştırmacılar amaçlarla herhangi bir sayı için, bu kök hücreler ve farklı nöronların yararlanabilirler hangi yöntemleri açıklanmaktadır. AGS bu adımları yakından takip ederek nöral kök hücreler, iki veya daha fazla pasajlar ile genişletilebilir ve sonra bölünen hücreleri sayısını en aza indirmek için toksik kimyasallar kullanmadan TUJ1 pozitif nöronların (~% 50) yüksek bir kültür için farklılaşmış. İskemi nöron 6 ve MEK / ERK ve PI3K/Akt hayatta kalma sinyalizasyon yolları, in vivo 7 ve in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew ve ark, hazırlanmakta) iskemi direncine katkıda bulunur üzerinden ilerler nöron neden olur. Bu eşsiz sinir hücrelerinin ileri karakterizasyonu, bazı veya tüm bu yöntemleri kullanarak, birçok cephede ilerleme.

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells at JoVE.com

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Sinir kök hücreleri, yetişkin olmayan kış uykusuna toklu Arctic zemin sincap (AGS) hipokampus hazırlanmıştır. Bu sinir kök hücreleri, sayısız kanallar sayesinde genişletilmiş, farklılaşmış ve glial kültürü neredeyse 50:50 nöron olarak muhafaza edilebilir.

Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Görüntüleme.  University of Alaska at Fairbanks. Sinir kök hücreleri, yetişkin olmayan kış uykusuna toklu Arctic zemin sincap (AGS) hipokampus hazırlanmıştır. Bu sinir kök hücreleri, sayısız kanallar sayesinde genişletilmiş, farklılaşmış ve glial kültürü neredeyse 50:50 nöron olarak muhafaza edilebilir.

Video: Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...