Ce travail a été financé par le Wellcome Trust au moyen de subventions à l&#39;APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] et un prix de base pour le Centre Wellcome Trust for Human Genetics [075491/Z/04].

Culture Cellulaire 1) <ol><li> Sélectionnez les types de cellules exprimant le gène d&#39;intérêt. </li><li> Sélectionner des lignées de cellules hétérozygotes à la fois pour des variantes de l&#39;ADN des risques et transcrit le polymorphisme de codage au sein du gène d&#39;intérêt (figure 1). </li><li> Culture des lignées cellulaires sélectionnées selon les spécifications du fournisseur et de préparer 2 x 10 cm boîtes de Pétri pour l&#39;extraction d&#39;ADN et d&#39;ARN, respectivement. </li><li> Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence lancer la procédure pour les cellules des récoltes et d&#39;isoler l&#39;ADN et l&#39;ARN soit en suivant la procédure décrite ci-dessous ou en utilisant des kits disponibles dans le commerce. </li></ol> Extraction de l&#39;ADN 2) <ol><li> Retirez le support de l&#39;antenne, se laver avec du PBS et ajouter au plat 500 ul d&#39;une solution de lyse (0,6% de SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, EDTA 20 mM et 50 ug / ml de RNase A). </li><li> Rocher de la plaque doucement pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Racler le lysat cellulaire dans un tube à centrifuger et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 100 pg / ml et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Extrait de l&#39;ADN avec un volume égal de phénol-chloroforme pH 8, répéter, puis extrait avec un volume égal de chloroforme / alcool isoamylique. </li><li> Précipiter l&#39;ADN avec 1 / 10 ème volume de NaCl 3 M et 2,5 volumes d&#39;éthanol 100%. </li><li> Laisser sur la glace pendant 5 min, puis tourner à 13000 rpm pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver l&#39;ADN à l&#39;éthanol 70%, permettant à l&#39;air sec et remettre en suspension dans 200 ul de TE. </li><li> Incuber à 65 ° C pendant 10 min puis laisser reposer 2 jours à température ambiante. </li><li> Conserver à 4 ° C ou à long terme à -20 ° C. </li></ol> 3) Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Retirez le support de l&#39;antenne, se laver avec du PBS, ajouter 1 ml de Trizol et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Racler les cellules, une pipette quelques fois, le transfert dans un microtube et incuber pendant 5 min. </li><li> Spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 200 ul de chloroforme. </li><li> Secouez et de spin pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un tube frais et ajouter un volume égal d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Chargez la solution à 1 ou 2 (selon le volume) et de spin colonne RNeasy pendant 30 sec à vitesse maximale. </li><li> De là, suivre les instructions du kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Préparation Nucleic Acid échantillon <ol><li> Quantifier l&#39;ADN et la concentration d&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Préparer ADNc à partir de 500-1000 ng d&#39;ARN en utilisant décamères aléatoire et SuperScript III de la transcriptase inverse (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. </li></ol> 5) PCR et Assay extension d&#39;amorce <ol><li> Conception de deux paires d&#39;amorces de PCR pour chaque marqueur d&#39;ADN, une paire pour l&#39;amplification de l&#39;ADN génomique et l&#39;autre paire pour l&#39;amplification de l&#39;ADNc (figure 2). Placez avant et arrière d&#39;amorces pour l&#39;amplification d&#39;ADNc dans les exons différents pour éviter la contamination génomique. Primer la conception pour obtenir un produit de PCR dans la gamme de 100-500 pb de longueur. </li><li> Préparer une réaction 10 uL de PCR dont 0,5 U de Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM de dNTPs, MgCl2 2 mM, 0,2 M de chaque amorce et 20 ng d&#39;ADNc ou ADN soit. Amplifier chaque échantillon en quatre réactions indépendantes. </li><li> Exécutez la réaction de PCR dans les conditions optimisées pour chaque paire d&#39;amorces garder le numéro du cycle en phase linéaire de l&#39;amplification. </li><li> Retirer amorces PCR et dNTPs excès en incubant le produit de PCR avec l&#39;exonucléase I et phosphatase alcaline de crevette (SAP) à 37 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Spot de chaque produit de PCR à deux reprises sur une plaque de 384 puits, de sorte que 8 mesures seront disponibles pour chaque échantillon. </li><li> Conception de l&#39;amorce d&#39;extension avec la conception Assay (Sequenom) logiciel de sorte que la même amorce peut être utilisée pour les deux génomiques et d&#39;ADNc produits de PCR. Précisez longueur de l&#39;amorce de la gamme de 14-18 pb et mélanger vulgarisation, y compris des combinaisons de 3ddNTPs (Fig 2). </li><li> Réaliser la réaction d&#39;extension d&#39;amorces et d&#39;analyse MALDI-TOF/MS utilisant le système MassARRAY (Sequenom) conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Une réaction typique de l&#39;extension d&#39;amorces comprennent une étape de départ à 94 ° C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de 94 ° C pendant 5 s, 52 ° C pendant 5 s et 72 ° C pendant 5 s. </li><li> Les produits d&#39;extension d&#39;amorces sont nettoyés avec de la résine SpectroCLEAN et transférés sur microréseau (puce) par SpectroPOINT nanolitre distributeur. </li><li> Les oligonucléotides étendu sont quantifiés par MALDI-TOF en utilisant un spectromètre de masse SpectroREADER. </li></ol> 6) Analyse statistique <ol><li> Vérifiez les résultats MALDI-TOF/MS avec le logiciel Typer MassARRAY pour la qualité générale de l&#39;expérience. </li><li> Extrait du rapport allélotypage qui comprend la zone de données de pointe. </li><li> Pour chaque spectre individuel calculer larapport entre la surface du pic de l&#39;allèle 1 et allèle 2 (rapport surface des pics). </li><li> Pour chaque échantillon d&#39;ADNc dérivent d&#39;une moyenne surface du pic ratio et l&#39;écart-type, en utilisant la fonction correspondante dans Excel, à travers les 8 mesures. </li><li> Dériver le même rapport de la surface moyenne de pointe à travers le 8 measurments pour l&#39;ADN génomique. </li><li> Diviser le rapport d&#39;ADNc dire par le ratio signifie génomique afin d&#39;évaluer l&#39;écart à l&#39;attendus ratio de 1:1. </li></ol> 7) des contrôles expérimentaux <ol><li> Pour écarter les artefacts expérimentaux, répéter l&#39;expérience au moins trois fois. </li><li> Autant que possible la conception des essais, des marqueurs d&#39;ADN supplémentaires. </li><li> Conception de plusieurs paires d&#39;amorces de PCR et des amorces d&#39;extension de recuit à des brins à la fois avant et arrière. </li><li> Chaque fois que possible, de test comme négatif contrôle des lignées cellulaires qui sont hétérozygotes pour les marqueurs de l&#39;ADN, mais ne portent pas le risque de variantes génétiques associées au phénotype (Fig. 1 et Fig. 3) </li></ol> 8) Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;allèle spécifique d&#39;analyse d&#39;expression est montré dans la figure 3, avec des exemples de traces par spectrométrie de masse. La figure montre les résultats de l&#39;analyse de quatre allèle-spécifique des produits d&#39;extension d&#39;amorces réalisées sur 4 modèles différents. Les graphiques haut représentent les résultats obtenus à partir de l&#39;analyse de l&#39;ADN génomique de deux lignées cellulaires différentes, qui sont tous deux hétérozygotes pour un polymorphisme transcrit codage. Toutefois, seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (figure 1). Les graphiques du bas représentent les résultats obtenus à partir de l&#39;analyse de l&#39;ADNc générés à partir des mêmes lignées cellulaires. En raison de l&#39;artefact expérimental premier pic est toujours plus élevé que le deuxième pic, même dans l&#39;analyse génomique. Par conséquent, les résultats de l&#39;analyse génomique sont utilisés pour normaliser les données d&#39;ADNc. Après la normalisation, le ratio allèle est significativement différent de 1 dans une lignée cellulaire (où le second pic apparaît faible par rapport aux spectres d&#39;autres), alors qu&#39;elle est très proche de 1 dans la lignée cellulaire B. Les données suggèrent que la lignée cellulaire Un porte une variante de l&#39;ADN, en phase avec l&#39;allèle mesurée par le deuxième pic, ce qui réduit l&#39;expression du gène en cours d&#39;analyse. Lignée cellulaire B fournit un contrôle très pratique négative. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Les lignées cellulaires stratégie de sélection de cellules en ligne. A et B sont hétérozygotes pour un marqueur de codage transcrit (triangle), mais seule lignée cellulaire A est hétérozygote pour la variante ADN risque (cercle). L&#39;allèle bleu de la variante de risque est associé (que ce soit avec un effet direct ou parce que en étroite corrélation avec la variante fonctionnelle réelle) avec un faible niveau de la transcription. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Allèle-spécifique de dosage extension d&#39;amorce. Ce chiffre montre le travail d&#39;écoulement de la procédure expérimentale menée à la fois pour l&#39;ADN d&#39;ADNc (à gauche) et de la génomique (à droite) des modèles. Des amorces de PCR (rectangles gris) sont conçues pour amplifier un polymorphisme hétérozygote codage (triangle). Pour éviter la contamination des amorces PCR génomique recuit séquences placées dans des exons différents (barres bleues) lorsque l&#39;amplification est réalisée sur matrice d&#39;ADNc. Le produit PCR est ensuite utilisé comme matrice pour une réaction d&#39;extension d&#39;amorces réalisée avec une amorce d&#39;extension, une base de recuit à côté du polymorphisme, et la combinaison appropriée de trois didésoxynucléotides (ddNTP) terminateurs (carrés) et un désoxynucléotides (cercle) pour étendre l&#39;apprêt d&#39;un ou deux de base respectivement. Les produits résultant d&#39;extension d&#39;amorces ont des masses différentes qui permettent la séparation et la quantification par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La quantité de produit correspondant à l&#39;allèle bleu du marqueur d&#39;ADN est relativement faible à l&#39;allèle rouge. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Résultats d&#39;un allèle spécifique de dosage d&#39;expression. La figure montre les résultats de spectrométrie de masse à partir de l&#39;analyse effectuée sur l&#39;ADN génomique et l&#39;ADNc de la lignée cellulaire A et B lignée cellulaire (figure 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Cette méthode permet d&#39;évaluer l&#39;effet des maladies associées aux variantes de l&#39;ADN sur l&#39;expression génique par l&#39;évaluation dans le allèle-spécifique in vivo de différence dans le niveau de transcription. Dans ce protocole d&#39;abondance relative est mesurée la transcription par MALDI-TOF, mais d&#39;autres technologies permettant la quantification allèle-spécifique, tels que TaqMan 6,7, peut être utilisé. La principale limitation de cette approche est la disponibilité des transcrits des marqueurs de codage. Méthodes basées sur le principe décrit ici, mais en profitant des différentes classes de polymorphismes ont été décrits. Le dosage de haploChip mesures spécifiques d&#39;un allèle d&#39;expression en utilisant des marqueurs situés dans 1 kb de l&#39;initiation de la transcription ou le site fin d&#39;un gène qui serait présent dans la chromatine du matériel immunoprécipité isolés avec des anticorps spécifiques à l&#39;ARN polymérase II 8. Alternativement, les SNP intronique peut être utilisé lorsque le modèle est hétéronucléaires ARN 9. Le protocole spécifique décrit ici, en combinaison avec le dosage haploChip, a été utilisée avec succès pour identifier un gène candidat pour la dyslexie (ou d&#39;un handicap de lecture). Initialement une étude d&#39;association génétique identifié une séquence d&#39;ADN associés à la dyslexie et qui a été couvrant trois gènes 10. L&#39;allèle épreuves spécifiques ont montré que l&#39;expression des gènes dans la présence de la dyslexie associée variations d&#39;expression d&#39;ADN variantes a été observé pour un seul des trois gènes, mais pas les deux autres 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

Le nombre d&#39;associations génétiques significatives avec des traits communs complexe est en constante augmentation. Cependant, la plupart de ces associations n&#39;ont pas été compris au niveau moléculaire. Un des mécanismes de médiation de l&#39;effet des variants d&#39;ADN sur des phénotypes est l&#39;expression des gènes, qui a été montré pour être particulièrement pertinent pour les traits complexes 1. Cette méthode teste dans un contexte cellulaire de l&#39;effet de séquences d&#39;ADN spécifiques sur l&#39;expression génique. Le principe est de mesurer l&#39;abondance relative des transcrits issus des deux allèles d&#39;un gène, l&#39;analyse des cellules qui portent une copie des séquences d&#39;ADN associées à la maladie (les variantes de risque) 2,3. Par conséquent, les cellules utilisées pour cette méthode doit répondre à deux exigences fondamentales génotypique: ils doivent être hétérozygotes à la fois pour le risque variantes de l&#39;ADN et des marqueurs de l&#39;ADN, polymorphismes généralement de codage, qui permet de distinguer les transcriptions en fonction de leur origine chromosomique (Figure 1). Variantes de risque de l&#39;ADN et des marqueurs d&#39;ADN n&#39;ont pas besoin d&#39;avoir la fréquence de l&#39;allèle mêmes, mais la phase (haplotypique) relation des marqueurs génétiques doit être comprise. Il est également important de choisir des types de cellules qui expriment le gène d&#39;intérêt. Ce protocole se réfère spécifiquement à la procédure adoptée pour extraire les acides nucléiques à partir de fibroblastes, mais la méthode est également applicable à d&#39;autres types de cellules, y compris des cellules primaires. ADN et ARN sont extraits à partir des lignées cellulaires sélectionnées et d&#39;ADNc est généré. ADN et d&#39;ADNc sont analysées avec un test d&#39;extension d&#39;amorces, conçu pour cibler les marqueurs d&#39;ADN codant 4. Le test extension d&#39;amorce est réalisée en utilisant les MassARRAY (Sequenom) 5 plate-forme selon les spécifications du fabricant. Produits d&#39;extension d&#39;amorce sont ensuite analysées par laser assistée par matrice de désorption / ionisation de temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS). Parce que les marqueurs sélectionnés sont hétérozygotes, ils génèrent deux pics sur les profils de MS. La surface de chaque pic est proportionnelle à l&#39;abondance et la transcription peut être mesurée avec une fonction du logiciel Typer MassARRAY pour générer un rapport allélique (allèle 1: allèle 2) du calcul. Le ratio obtenu pour allélique ADNc est normalisé en utilisant celle mesurée à partir d&#39;ADN génomique, où le ratio allélique devrait être de 1:1 pour corriger les artefacts techniques. Marqueurs avec un ratio normalisé alléliques significativement différente de 1 indiquent que la quantité de transcrit généré par les deux chromosomes dans la même cellule est différente, ce qui suggère que les variantes génétiques associées au phénotype ont un effet sur l&#39;expression des gènes. Contrôles expérimentaux devraient être utilisées pour confirmer les résultats.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Associations génétiques restent souvent inexpliquées au niveau fonctionnel. Cette méthode vise à évaluer l&#39;effet du phénotype associé marqueurs génétiques sur l&#39;expression des gènes par l&#39;analyse de cellules hétérozygotes pour SNP transcrites. La technologie permet une mesure précise par MALDI-TOF spectrométrie de masse pour quantifier allèle-spécifique des produits d&#39;extension d&#39;amorces.

Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l&#39;épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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Research

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Biology

22.7K vues.  University of Oxford. Associations génétiques restent souvent inexpliquées au niveau fonctionnel. Cette méthode vise à évaluer l'effet du phénotype associé marqueurs génétiques sur l'expression des gènes par l'analyse de cellules hétérozygotes pour SNP transcrites. La technologie permet une mesure précise par MALDI-TOF spectrométrie de masse pour quantifier allèle-spécifique des produits d'extension d'amorces.

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Test de transition clair / foncé pour souris

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

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Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...