Ce travail est soutenu par le National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) et le RMRCE (NIH AI065357).

Le protocole suivant est écrit pour la production et l&#39;utilisation d&#39;un ATS fondée sur le virus Sindbis MRE16. L&#39;ATS est conçu pour exprimer la GFP dans le moustique vecteur Aedes aegypti. ADNc clones infectieux d&#39;un certain nombre d&#39;alphavirus (virus Sindbis, virus Chikungunya, O&#39;nyong-Nyong, le virus de l&#39;encéphalite équine de l&#39;ouest) sont actuellement disponibles qui ont été conçus comme des ATS (tableau 1). Pour de meilleurs résultats ADN plasmidique est amplifié dans des bactéries telles que VOUS bactéries compétentes (Stratagene / Agilent Technologies) afin d&#39;éviter la recombinaison indésirables et la perte de l&#39;ADNc viral. Tous les plasmides clone infectieux ont un bacteriophage T7 ou SP6 promoteur lors de la 5 immédiate &quot;fin de l&#39;ADNc viral pour la transcription de l&#39;ARN génomique pleine longueur et une endonucléase de restriction unique à l&#39;extrémité 3 &#39;de la transcription du ruissellement. Pour chaque SNP, les utilisateurs doivent utiliser l&#39;ADN approprié bactériophage dépendante de l&#39;ARN polymérase et l&#39;endonucléase de restriction unique pour transcription in vitro de l&#39;ARN génomique viral. 1. Génération de l&#39;ARN du clone d&#39;ADNc infectieux. <ol><li> Linéariser le 5 ug du clone infectieux plasmide (p5&#39;dsMRE16 / GFP) avec 20 unités d&#39;enzyme de restriction XhoI dans une réaction de 100 ul. Incuber pendant 2-3h à 37 ° C </li><li> Purifier l&#39;ADN linéarisé en utilisant Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit protocole de purification de remplacement, en éluant d&#39;ADN de colonne de centrifugation avec 50 uL d&#39;eau sans RNase. La concentration plasmidique devrait être d&#39;environ 1,0 ug / uL. </li><li> Dans un tube sans RNase de 0,2 ml par PCR, mise en place d&#39;une réaction de transcription 50 uL utilisant Ambion MAXIscript kit par le protocole comme suit. <ul><li> 22,5 uL RNase dH 2 O <ul><li> 5.0 template uL ADN linéarisé (1,0 ug / uL) </li><li> 2,5 ul 10mM ATP </li><li> 2,5 ul 10mM CTP </li><li> 2,5 ul 10mM UTP </li><li> 2,5 ul 1mM GTP </li><li> 2,5 ul 10mM bouchon analogique (m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G) </li><li> 5,0 pi de tampon de transcription 10X </li><li> 5,0 uL T7 ou SP6 mélange de polymérase </li></ul></li><li> 50,0 Total uL </li></ul></li><li> Incuber la réaction de transcription pendant 1 heure à 37 ° C. Après incubation, la réaction doit être utilisé immédiatement pour l&#39;électroporation des cellules BHK-21. Préparation des cellules BHK-21 pour l&#39;électroporation devrait commencer au cours de réaction de transcription d&#39;incubation. </li></ol> 2. Génération du virus à partir d&#39;ARN infectieuses <ol><li> Trypsiniser deux confluents de 70-80% à 150 cm 2 (T-150) flacon cellules BHK-21 par l&#39;ATS. </li><li> Transférer toutes les cellules dans un tube de 15 ml à centrifuger conique. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 2000 rpm, 10 min, 4 ° C dans une centrifugeuse de table conventionnelle. </li><li> Resuspendre les cellules dans du PBS stérile, sans Mg + + et Ca + +. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 jusqu&#39;au cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. </li><li> Reprendre le granulé cellules MEM 0,5 ml contenant 10% de FBS. </li><li> Diluer 10 cellules avec 90 uL MEM uL avec 10% de FBS et compter sur un hématimètre. Si nécessaire, les cellules diluer à 2.5 au 12.5 x 10 7 cellules / ml avec du MEM contenant 10% de FBS. </li><li> Pour une glace froide 0,2 cm cuvette d&#39;électroporation, ajouter 400 cellules en suspension et 20 uL réaction de transcription ul. Essuyez la condensation de la cuvette. </li><li> Impulsion de la cuvette deux fois: 450V, 1200Ω, 150 pF. Nous utilisons une cellule électro Manipulateur, Harvard Apparatus modèle ECM630. </li><li> Placez le contenu de la cuvette dans un flacon de 25 cm 2 de culture de tissus contenant 5 ml MEM avec 10% de FBS. </li><li> Incuber flacon (s) à 37C avec 5% de CO 2. </li><li> Surveiller l&#39;infection quotidienne à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé fluorescent avec ensemble de filtres appropriés (par exemple la GFP filtre: longueur d&#39;onde d&#39;excitation = 460-490 nm, longueur d&#39;émission = 510 à 550 nm, ou DsRed filtre: longueur d&#39;onde d&#39;excitation = 460-560 nm, longueur d&#39;onde d&#39;émission =&gt; 590 nm). </li><li> Lorsque l&#39;infection est la fluorescence suggère confluentes et / ou CPE est visible partout dans le flacon, de recueillir le contenu de la fiole, ajouter 30% de FBS, partie aliquote que nécessaire, et conserver à -80 ° C. Si désiré, lysats de cellules peut être clarifié par centrifugation (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) avant l&#39;addition de FBS. </li><li> Passage de virus au moins une fois par un nouveau flacon de cellules pour augmenter le titre du virus pour les dosages ultérieurs nourrir de sang. </li></ol> 3. Per os infection des moustiques <ol><li> Mélanger le sang (généralement achetés sang de mouton de-fibrinated) et de culture de cellules de suspension de virus provenant de l&#39;étape 2.13. Titre du virus dans le final le repas de sang normalement devrait être ~ 1x10 7 unités formant plaque (UFP) / ml pour une infection intestin moyen efficace de le moustique. Afin de stimuler les moustiques pour engorger, l&#39;adénosine 5&#39;-triphosphate (ATP) peut être ajoutée à une concentration finale de 0,02 M. </li><li> Les moustiques peuventdoivent être privés d&#39;eau et de sucre avant l&#39;infection à les stimuler pour nourrir efficacement le sang à partir d&#39;un chargeur artificielle. Durée de la privation doit être préalablement mis en place pour minimiser la mortalité. Les temps dépendra de l&#39;espèce de moustique, l&#39;humidité de l&#39;insectarium etc Comme point de départ, enlever le sucre et 24h à 12h l&#39;eau avant de l&#39;alimentation. Ce protocole utilise chemise d&#39;eau en verre avec feeders17 circulant à 37 ° C l&#39;eau. Une membrane intestinale porcine (c&#39;est à dire lavés saucisses boîtier disponible à la plupart des épiceries) est placé sur la bouche de l&#39;alimentation et le repas est à la pipette dans la chambre. Différentes conceptions, les membranes et les protocoles sont disponibles pour les types de vecteurs différents. </li><li> Les moustiques sont triées pour ne sélectionner que les moustiques gorgées de sang. Moustiques gorgés sont transférés à un carton avec organdi sur le dessus et les moustiques sont incubées à 28 ° C, 75-80% d&#39;humidité relative jusqu&#39;à traitées pour expression de la GFP. </li></ol> 4. L&#39;inoculation intrathoracique des moustiques L&#39;inoculation intrathoracique est une méthode alternative pour infecter les arthropodes. Cette méthode est utilisée lorsque la diffusion par le biais de l&#39;intestin moyen n&#39;est pas nécessaire. (Méthode décrite ci-dessous, mais la technique n&#39;est pas démontré dans cette expérience visuelle). <ol><li> Un petit nombre de moustiques (5-10) est aspiré par les cages en plastique de maintien dans les tubes de maintien. Les tubes scellés holding sera placé à 4 ° C pendant 15 min pour refroidir les moustiques. </li><li> 2 5 moustiques sera versé à partir du tube sur un plat en verre de Pétri reposant sur la glace. Placer le couvercle sur la boîte de Pétri lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé ou si les moustiques commencent à se déplacer. Pendant la manipulation des moustiques, il faut prendre soin de compter et de garder trace du nombre de moustiques d&#39;être manipulé. Comme les moustiques sont déversés sur la table de refroidissement, le nombre total seront enregistrées sur un compteur de laboratoire. </li><li> L&#39;aiguille est préparé par fusion tube capillaire en verre à l&#39;aide Nanoject spécifiques et un extracteur d&#39;aiguilles. </li><li> Configuration du Nanoject II microinjecteur selon les instructions du fabricant pour la livraison de 69 nL d&#39;inoculum. Il faut être prudent lors de l&#39;élaboration de l&#39;inoculum dans l&#39;aiguille pour que l&#39;aiguille n&#39;est pas endommagé. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, insérer l&#39;aiguille dans le thorax du moustique et d&#39;activer le Nanoject pour l&#39;inoculation. Des précautions doivent être prises lors de l&#39;inoculation des moustiques afin que l&#39;aiguille n&#39;a pas pénétrer complètement le moustique et la sortie de l&#39;autre côté, ce qui entraîne la mort subséquente du moustique. Vérifiez chaque moustique pour être sûr que l&#39;inoculum est entré avant de le retirer de l&#39;aiguille. </li><li> Après l&#39;inoculation, tandis que le moustique est encore empalé sur l&#39;aiguille, le placer dans un carton de papier tenant travers un petit trou dans le côté qui est bouché avec du coton ou un bouchon de liège à tout autre moment. </li><li> Lorsque les moustiques ont ensemencé et placé dans le carton (jusqu&#39;à environ 50 par carton), soigneusement bandes du liège en place pour prévenir la libération accidentelle de moustiques. Placez les cartons dans une poubelle maintenant sécurisé avant d&#39;incubation plus loin dans l&#39;insectarium à 28 ° C% d&#39;humidité et 80 relatives. </li></ol> 5. Infection Surveillance des moustiques <ol><li> Placez le papier carton maintien à 4 ° C pendant environ 15 minutes pour immobiliser les moustiques. </li><li> Transfert d&#39;un petit nombre de moustiques (5-10 à la fois) à une table de froid adaptée pour une utilisation sur un microscope à fluorescence. </li><li> Examiner et trier les moustiques basée sur la présence ou l&#39;absence de fluorescence. En outre, les fluorescents intensité peut être utilisé comme une mesure quantitative de l&#39;infection par procuration. Mosquito tissus tels que estomacs, les glandes salivaires, la graisse corporelle peut être disséqué et surveillées pour la fluorescence. </li><li> Le cas échéant, le retour des moustiques choisi pour carton de papier pour continuer d&#39;incubation de moustiques infectés. </li></ol> 6. Essai de transmission (salivation obligée de manifester la transmission du virus) <ol><li> Priver les moustiques de la source de sucre pendant 24 h avant de se nourrir. </li><li> Retirer les jambes et les ailes </li><li> Pour un 50 tube capillaire uL qui a été chauffé, tiré et ciselée à une extrémité, ajouter 3-5 uL d&#39;Cargille type huile d&#39;immersion B ou 10% de sérum-saccharose solution. </li><li> Insérez la trompe dans le tube. Si vous utilisez l&#39;huile, les gouttelettes de salive sera vu à exsuder de la trompe. Un uL d&#39;une solution pilocarbine 1% dans du PBS et 0,1% de Tween 80 peut être appliqué au thorax à stimuler. </li><li> Après 60-90 minutes, enlever les moustiques et magasin pour l&#39;isolement du virus, si nécessaire. </li><li> Retirer solution du tube par centrifugation dans un tube contenant 100 uL 20% de FBS-PBS. </li><li> Filtre stérile de l&#39;inoculum à travers un filtre seringue de 0,2 um, puis utiliser la filtrée de l&#39;inoculum pour infecter les cellules cultivées. </li></ol> REMARQUE BIOSECURITE: Ce protocole décritune méthode pour générer, identifier, et le suivi des moustiques infectés. Basé sur vos installations (c.-à une table de refroidissement, des installations de confinement, etc) et à l&#39;approbation du BAC, vous pouvez être limité à leur seul examen après avoir enlevé les ailes et les jambes pour empêcher la fuite. SINV basé ATS peuvent être générés et utilisés dans un environnement BSL2. L&#39;utilisation de l&#39;ATS est basé sur d&#39;autres alphavirus tels que le Chikungunya virus ou virus de l&#39;encéphalite équine, il faudra BSL3 installations. 7. Les résultats représentatifs Un aperçu de l&#39;expression d&#39;un gène marqueur (GFP) en utilisant le 5&#39;dsMRE16 ATS / GFP est montré dans la figure 1. Expression de la GFP dans les cellules BHK-21 et C6/36 (Aedes albopictus) cellules est illustré à la figure 2 à des moments précis après l&#39;infection des cellules avec 5&#39;dsMRE16 / GFP virus à 0,01 multiplicité d&#39;infection. La figure 3 est une vue d&#39;ensemble de l&#39;infection virale d&#39;alphavirus et ATS dans le moustique, lorsque le virus est livré par un repas de sang infectieux. La figure 4 montre la préparation d&#39;un repas de sang avec ~ 10 7 pfu / ml de virus ATS suivie par une infection orale d&#39;Aedes aegypti. Vue d&#39;ensemble du corps moustique infecté et les parties du corps sélectionné à 10 jours après l&#39;infection en utilisant un microscope à épifluorescence (Figure 5). La détection de la GFP et dsRED en estomacs de moustiques infectés suite à une infection avec des virus exprimant ATS 5&#39;dsMRE16 chaque gène marqueur fluorescent (figure 6). Test de transmission utilisant des moustiques infectés par 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS virus (figure 7). Tableau 1. ATS est actuellement conçu pour l&#39;expression des gènes chez les moustiques. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alphavirus </td><td> ATS </td><td> Moustiques </td><td> Référence </td></tr><tr><td> Virus Sindbis </td><td> TE / 3&#39;2J et TE / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 et 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. AEG ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le virus Chikungunya </td><td> 3&#39;dsCHIKV et 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong Nyong virus </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le virus de l&#39;encéphalite équine occidentale </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al., Inédit </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Avantages / inconvénients de l&#39;utilisation ATS pour l&#39;expression des gènes chez les moustiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Avantages: </td></tr><tr><td> Production rapide de titre élevé de virus </td></tr><tr><td> Large gamme d&#39;hôtes (SINV) </td></tr><tr><td> Taux élevé de réplication de l&#39;ARN </td></tr><tr><td> Des taux élevés de l&#39;expression du transgène </td></tr><tr><td> Relative facilité de manipulation des gènes </td></tr><tr><td> Stable, l&#39;expression des gènes persistants dans les insectes </td></tr><tr><td> Minimal pathologie des insectes </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Inconvénients: </td></tr><tr><td> Mode d&#39;expression à court terme dans les cellules de vertébrés </td></tr><tr><td> Forte des effets cytopathiques sur les cellules de vertébrés </td></tr><tr><td> Restrictions de taille Gene (&lt;1 Ko, idéalement) </td></tr><tr><td> Certains nécessitent alphavirus BSL3 confinement </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Vue d&#39;ensemble de la production de virus ATS cellules BHK-21 en utilisant p5&#39;dsMRE / GFP GFP SINV exprimer. Après transcription in vitro, génomique ATS ARN est une électroporation dans les cellules BHK-21 où le virus est sauvé. Le virus ATS peut alors être utilisé pour infecter les moustiques. PSC = promoteur subgénomique. Trois espèces d&#39;ARN ATS sont transcrits dans le CELls, le génomiques, subgénomiques 1 et 2 ARN subgénomiques. C (capside), glycoprotéines E2 et E1 sont assemblés avec ATS génome pour générer un virus infectieux. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Expression de la GFP dans les moustiques (C6/36), les cellules après infection par SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Aperçu d&#39;une infection par le virus chez les moustiques ATS menant à la transmission du virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 infection par exposer les moustiques à un repas de sang infectieux. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP infection à 10 jours après l&#39;infection. La détection du corps entier de la GFP montre que le virus s&#39;est échappé de l&#39;intestin et diffusé aux tissus secondaires. La figure montre aussi l&#39;expression de GFP dans les parties du corps sélectionné qui est aussi révélatrice d&#39;une infection disséminée. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP et 5&#39;dsMRE16 / infection dsRED des estomacs à des moments précis après l&#39;infection. Estomacs ont habituellement des foyers distincts d&#39;infection précoce après l&#39;ingestion d&#39;un virus repas de sang contenant qui se propage dans l&#39;intestin moyen postérieure à des moments plus tard, après l&#39;infection. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7: Détection des ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP dans la salive de moustiques dès 8 jours après l&#39;infection. Test est destiné à montrer la transmission du virus ATS et montre que le virus 5&#39;dsMRE16 / GFP peut expriment de façon stable la GFP pendant toute la période d&#39;incubation extrinsèque chez le moustique. Le panneau de gauche montre un moustique saliver dans un tube capillaire, le panneau central montre C6/36 cellules infectées avec de la salive à 1 jour et panneau de droite 3 jours après l&#39;infection.

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	<li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+patterns+of+o'nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae.">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li><li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection.">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li><li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li><li>Capurro, d. e. L. a. r. a., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-expressed,+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti.">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li><li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species.">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li><li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+transducing+systems.">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li><li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li><li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation.">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li><li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O'nyong-nyong+virus+(Alphavirus;+Togaviridae)+infection+of+Anopheles+gambiae.">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors.">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li><li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes.">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes.">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+(C6/36)+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus.">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection.">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li><li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus.">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li><li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti.">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li><li>Rutledge, L. C. W. a. r. d., A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder.">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li><li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti.">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li><li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis.">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li><li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

Les méthodes présentées ici permettent aux chercheurs de suivre l&#39;infection d&#39;un alphavirus de la culture de cellules de moustique et le moustique femelle adulte. Les avantages et les inconvénients de l&#39;utilisation des virus ATS sont résumées dans le Tableau 2. Un SNP clone infectieux peuvent être manipulées génétiquement pour exprimer toute GOI et ont été utilisés pour exprimer des anticorps à chaîne simple, des suppresseurs de RNAi, ARN antisens ciblant les gènes endogènes, et pro-apoptotiques des protéines. Si un journaliste n&#39;est pas utilisé, alors la portion de cette méthode d&#39;imagerie n&#39;est pas pertinente. Cependant, la plupart des mêmes protocoles sont nécessaires pour le sauvetage du virus ATS, la propagation et l&#39;infection des moustiques. Il ya des limites à la taille maximale du transgène lorsqu&#39;il est inséré dans un système de transduction alphavirus. Les contraintes de taille varient en fonction de la souche parentale utilisée pour produire de l&#39;ATS, mais sont généralement d&#39;environ 1kb bien gènes rapporteurs grands tels que la luciférase de luciole ont été utilisés dans la construction d&#39;ATS pour une utilisation chez les moustiques. Les laboratoires de recherche avec une quantité modeste de fond de virologie devraient être en mesure d&#39;utiliser ATS suivant ces protocoles. Un certain nombre de laboratoires de recherche ont déjà fait à l&#39;aide SINV basé ATS.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alphavirus systèmes de transduction (SNP) sont des outils importants pour exprimer des gènes d&#39;intérêt (GOI) lors de l&#39;infection. SNP sont issus de clones d&#39;ADNc de virus à ARN transmis par les moustiques (genre Alphavirus; famille des Togaviridae). Le genre Alphavirus contient environ 30 espèces différentes de virus transmis par les moustiques. Alphavirus sont des virus enveloppés et contiennent un seul brin génomes ARN (~ 11,7 Kb). Alphavirus transcrire un ARNm sous-génomiques qui code les protéines structurales du virus nécessaire à l&#39;encapsidation du génome et de la maturation du virus. Alphavirus sont généralement très lytique dans les cellules de vertébrés, mais persistante infecter les cellules de moustique sensible avec un minimum de cytopathologie. Ces attributs rendent d&#39;excellents outils pour l&#39;expression des gènes dans les moustiques vecteurs. Le SNP les plus couramment utilisés sont dérivés de virus Sindbis (SINV). Le tropisme espèces éventail de SINV permet d&#39;infection des cells8 insectes, oiseaux et mammifères. Toutefois, les SNP ont été tirés autres alphavirus ainsi 9,10,20. L&#39;expression des gènes étrangers est rendue possible par l&#39;insertion d&#39;un site supplémentaire subgénomiques virale ARN d&#39;initiation ou de promoteur. SNP dans lequel une séquence d&#39;un gène exogène est placé à 5 &#39;de la structure des gènes viraux est utilisé pour l&#39;expression des protéines stables chez les insectes. SNP, dans lequel une séquence d&#39;un gène est positionné 3 &#39;des gènes de structure, est utilisé pour déclencher l&#39;expression de RNAi et le silence de ce gène dans l&#39;insecte. SNP se sont révélés être des outils précieux pour la compréhension des interactions vecteur-pathogène, les détails moléculaires de la réplication virale et des cycles de maintenance infectieuses 3,4,11,19,21. En particulier, l&#39;expression de journalistes fluorescentes et bioluminescents a joué un rôle de suivi de l&#39;infection virale dans la transmission du virus vecteur et 5,14-16,18. De plus, la réponse immunitaire de vecteurs a été décrit en utilisant deux souches de SINV pour exprimer la GFP 2,9. Ici, nous présentons une méthode pour la production de SINV contenant un journaliste fluorescente (GFP) à partir du clone d&#39;ADNc infectieux. Infectieuses, pleine longueur ARN est transcrit à partir du clone d&#39;ADNc linéarisées. ARN infectieux est introduit dans les cellules cibles permissives par électroporation. Les cellules transfectées générer des particules virales infectieuses exprimant l&#39;IGE. Virus récolté est utilisé pour infecter les moustiques, telles que décrites ici, ou d&#39;autres espèces hôtes (non représenté ici). Compétence vectorielle est évaluée par la détection de fluorescence à l&#39;extérieur de l&#39;intestin moyen ou par la transmission du virus de surveillance 7. Utilisation d&#39;un rapporteur fluorescent que les pouvoirs publics indiens permet d&#39;estimer facilement la propagation du virus à travers une culture cellulaire, pour la détermination du taux d&#39;infection, la diffusion des moustiques exposés, la transmission du virus du moustique et fournit un indicateur rapide de la compétence vectorielle.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Méthodes d&#39;utilisation des systèmes de transduction alphavirus pour exprimer des reporters fluorescents in vitro et chez les moustiques adultes sont décrits. Cette technique peut être adaptée pour exprimer toute protéine d&#39;intérêt en remplacement ou en complément à un journaliste.

Système Alphavirus Transducing: des outils de visualisation des infections dans les moustiques vecteurs

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K vues.  Colorado State University. Méthodes d'utilisation des systèmes de transduction alphavirus pour exprimer des reporters fluorescents in vitro et chez les moustiques adultes sont décrits. Cette technique peut être adaptée pour exprimer toute protéine d'intérêt en remplacement ou en complément à un journaliste.

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Recherche

Immunologie et infection

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...