Institut des sciences translationnelle UTMB-NIH 1UL1RR029876-01 et Alisha Prather pour son aide avec le montage vidéo pour ce manuscrit.

1. Préparation des animaux <ol><li> L&#39;arrivée des animaux: A votre arrivée à l&#39;échelle de l&#39;animal biosécurité 2 (ABSL2) les installations, permettre aux animaux un minimum de 2 jours pour s&#39;acclimater à leur nouvel environnement. Après cette période de repos, inspecter les animaux pour évaluer leur état de santé et l&#39;apparence physique. <ol><li> Lors de l&#39;utilisation rapporteurs fluorescents, il est important de placer tous les sujets animaux sur un régime alimentaire de la luzerne libres de limiter la quantité d&#39;autofluorescence et GI signal de fond. </li></ol></li><li> Rasage animaux: Pour améliorer le signal bioluminescent détecté à partir de la région crânienne lors de l&#39;imagerie, raser les têtes de tous les animaux. Anesthésier les animaux avec un mélange de gaz oxygène vaporisé et l&#39;isoflurane. Une fois que les animaux sont pleinement anesthésiés, utilisez une tondeuse électrique se raser la tête. Une fois terminé avec le rasage, renvoyer les animaux dans leurs cages et d&#39;observer une récupération complète des effets de l&#39;anesthésie. </li><li> Bio Medic donnéesL&#39;insertion des systèmes de transpondeur (BMDS) (qui aura lieu après le rasage de la souris alors que les animaux sont pleinement anesthésiés): Pour un moyen moins invasives pour suivre la température d&#39;un implant préprogrammé BMDS sans fil transpondeur voie sous-cutanée dans la région dorsale de chaque souris. Ces transpondeurs permettent d&#39;identifier sans fil et enregistrement de la température. Après l&#39;implantation du transpondeur, appliquer un adhésif tissulaire vétérinaire de qualité de la plaie. </li><li> Collection de référence: Avant l&#39;infection, enregistrer une température de référence et le poids de tous les animaux. Prélever du sang pour la réduction de neutralisation sur plaque d&#39;essai (PRNT) l&#39;analyse par rétro-orbitaires (RO) de fond perdu, tandis que les souris sont sous anesthésie. Après prélèvement de sang, vétérinaire pommade oculaire antibiotique pour réduire le potentiel infection bactérienne secondaire. Cette collection de référence devrait être complétée en tenant compte du nombre de fois où les animaux sont placés sous anesthésie à cause du stress sur les souris. Futures collections RO should être complété après l&#39;imagerie, tandis que la souris est toujours sous anesthésie. Le sang prélevé sur un maximum de RO devrait être d&#39;environ 200 pi. </li><li> Infection: souris sous anesthésie comme décrit précédemment. Inoculer par voie intranasale à l&#39;aide d&#39;une dose de 5x10 6 à 5x10 7 pfu TC83-luciférase dans un volume total de 40 ul diluée par Phosphate Buffered Saline (PBS) à travers une infection intranasale. Après l&#39;infection, placez la souris au sein de leur cage de logement et d&#39;observer la récupération. </li></ol> 2. Imagerie des animaux Avertissement: Gardez souris au sein de leur unité de logement, l&#39;enceinte de sécurité biologique (ESB), ou la boîte de confinement XIC à tout moment. Les enceintes de sécurité biologique approuvés pour ce protocole sont de type B1 ou B2 de classe II. <ol><li> Injecter tous les animaux avec 10 pl par gramme de poids corporel de intrapéritonéale (IP) de la luciférine à une concentration de 15 mg / ml. <ol><li> Les souris ayant reçu Ampligen doivent être injecteIP d à une dose de 12,5 mg de poids corporel / kg lors de l&#39;infection heures après -4 ou 48 h après l&#39;infection en fonction de leur groupe. </li></ol></li><li> Avant l&#39;injection avec la luciférine, séparer les souris en groupes de trois pour assurer un ajustement approprié dans la boîte de confinement XIC-3. <ol><li> Pour toutes les images, utiliser une pommade oculaire / lubrifiant pour empêcher le séchage de la cornée dans toute la procédure. </li></ol></li><li> Ouvrez le logiciel LivingImage et appuyez sur Initialiser pour préparer la boîte d&#39;imagerie; économie d&#39;auto ensemble, le temps d&#39;exposition sur auto (temps d&#39;exposition sur auto est une nouvelle fonctionnalité du logiciel LivingImage 3.2 et plus récent), voir le terrain à C, et le filtre à ouvrir; champ de vue est fondée sur le nombre de souris vous êtes imagerie; filtre et peut être optimisé en fonction des besoins pour des projets d&#39;imagerie. </li><li> Assurez-vous que les filtres à charbon air n&#39;ont pas expiré, le réservoir d&#39;oxygène est pleine, l&#39;isoflurane et le réservoir est rempli. Placez de petites bandes de ruban électrique dans le XIC-3 iboîte de consolation qui aide à réduire le déplacement des animaux lors de l&#39;imagerie. </li><li> Injecter les souris avec la luciférine IP, comme décrit dans la section 2.1 et sa place dans la chambre d&#39;induction isoflurane (avec couvercle ouvert) pendant 3-5 min. </li><li> Après 5 minutes, fermez le couvercle de la chambre d&#39;induction et démarrer le flux de l&#39;isoflurane. L&#39;anesthésique est actionné à environ 3-5% de l&#39;ensemble de débits d&#39;écoulement d&#39;oxygène à environ 2,0 L / min. Une fois complètement inconscient attendre un autre 30 secondes et transférer les souris à la boîte d&#39;isolation XIC-3. S&#39;assurer que le poste de sécurité microbiologique étant utilisée permet le coffre-fort balayage de l&#39;isoflurane que cette procédure implique la perte de l&#39;isoflurane à partir de la chambre d&#39;induction (l&#39;unité IVIS contient ses propres passifs bidons équitable et la boîte de confinement XIC-3 se connecte directement à l&#39;entrée / sortie prises pour assurer contenues flux anesthésique). <ol><li> Transférez les souris basés sur puce / numéro de groupe dans la boîte d&#39;isolation XIC-3 avec le connecteur isoflurane ci-joint und ouvrir. Placez la souris de sorte qu&#39;ils sont énoncés en décubitus sternal avec des têtes délicatement posées sur les rubans adhésifs. </li></ol></li><li> Essuyez la zone de confinement XIC avec les mains éthanol de pulvérisation, et le fond du XIC-3 avec CaviCide, et transférer à la chambre d&#39;imagerie IVIS. Rebranchez l&#39;anesthésie de la zone de confinement fois à l&#39;intérieur de l&#39;unité d&#39;imagerie. </li><li> Après 10 minutes après l&#39;injection de luciférine, l&#39;image des souris via le logiciel vivante image. </li><li> Suite à l&#39;imagerie initiale avec un filtre ouvert, lancez une DLit 3-Dimensional imagerie utilisant l&#39;analyse de la séquence et la configuration Assistant Image de bioluminescence luciférase de luciole. Ce processus d&#39;imagerie prendra 4-5 min et devrait être achevée dans un champ de vue pertinent pour le nombre de souris souhaités. <ol><li> Ex-vivo analyse est possible autopsie suivante et la collecte du cerveau. Placez le cerveau sur une boîte de Pétri stérile, goutte à goutte 50-100 ul de stock luciférine sur le dessus, et sa place dans l&#39;imaGing boîte. </li></ol></li><li> Finaliser une seconde image ouverte filtre à 15-17 min après l&#39;infection à la fin de l&#39;imagerie DLit. Assurer une analyse de séquence est éteint et le champ de vision et les paramètres de filtre sont retournés à la configuration précédente. </li></ol> 3. Souris de retour et d&#39;analyse de données <ol><li> Éteignez le vaporisateur isoflurane et le transfert de la zone de confinement XIC retour à l&#39;enceinte de sécurité biologique. </li><li> Placez les souris de retour au sein de leur unité de logement, fermer le haut, vaporiser l&#39;extérieur avec un désinfectant approprié et remettez le casier de stockage. <ol><li> Veiller à ce que les souris ont complètement récupéré de l&#39;anesthésie. </li></ol></li><li> Répétez la procédure ci-dessus jusqu&#39;à ce que l&#39;expérience nécessite d&#39;imagerie est terminée. </li><li> Désinfecter le BSC, arrêtez l&#39;appareil et transférer toutes les données vers un emplacement en dehors de laboratoire pour une analyse ultérieure. </li><li> Analyser les données et de générer des images en 3 dimensions basées sur les résultats IVIS utiliser le logiciel LivingImage. <ol><li> S&#39;assurer que l&#39;image est correctement orientée et l&#39;éclairage / balance des couleurs est réglé. Dans la palette d&#39;outils des options incluent Réglage de l&#39;image, les services correctionnels, Informations sur l&#39;image et les outils de ROI. </li><li> Utiliser des formes ROI d&#39;identifier les forces de signaux spécifiques sur la base de l&#39;emplacement. </li><li> Reconstruire la topographie de la surface pour mettre en évidence le corps de la souris, initialiser la reconstruction 3D DLit, et utiliser un ajustement linéaire pour définir la carte d&#39;organes à la reconstruction topographique. </li></ol></li><li> Une analyse plus titrage viral peut être complété par la collecte de sang et les organes. Le titrage dans cette étude a été réalisée par l&#39;homogénéisation du tissu cérébral dans aigles modifié moyenne (MEM). L&#39;homogénat a été dilués en série et nous avons infecté une plaque à 6 puits de cellules Vero pendant 1 heure. Les cellules ont été recouvertes d&#39;une superposition agarose/2xMEM 1,5% et incubées pendant 2 jours à 37 degrés. Les cellules ont été fixées avec 10% de formol pendant 30 min et colorées aveccristal violet. </li></ol>

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	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Bien que ce protocole couvre les aspects d&#39;imagerie pour l&#39;analyse in vivo, il est important de reconnaître le vecteur bioluminescente comme un facteur clé pour de futures études. Notre utilisation de TC83, une souche vaccinale atténuée de VEEV, comme un vecteur d&#39;expression de la luciférase en sorte que de grandes quantités de l&#39;enzyme sont produites en raison du taux élevé de réplication du virus dans le SNC, comme décrit précédemment 1-4. Bien que l&#39;ajout ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> D-luciférine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS système (Spectrum) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Système d&#39;anesthésie XGI-8-gaz </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîte de confinement XIC-3 </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 Logiciel </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Télémétrie / identification des puces </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> TSIP-300 </td><td> L&#39;identification des animaux et Temperrature </td></tr><tr><td> Seringue BD Integra TB 1 ml avec 26 gx 3/8 &quot;aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> Adhésif tissulaire Vet Bond </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Pommade ophtalmique Vetropolycin </td><td> Webster produits vétérinaires </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de Dulbecco saline tamponnée 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS Chip Lecteur </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST Software </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td></td><td> Utilisé pour télécharger des informations sonde </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

Avancées modernes dans la technologie d&#39;imagerie encourager le développement et l&#39;affinement de la façon dont la recherche virale est accompli. Initialement proposé par Russel et Burch en 3R Hume (remplacement, réduction, raffinement), l&#39;utilisation de modèles animaux dans la recherche scientifique est sous pression constante afin d&#39;identifier de nouvelles méthodes pour réduire l&#39;utilisation des animaux, tout en améliorant la précision scientifique et de rapidité. Un défi majeur pour les directeurs de Hume cependant, est de savoir comment s&#39;assurer que les études sont exacts, tout en réduisant la morbidité des maladies animales et chiffres globaux. Études sur l&#39;efficacité des vaccins actuellement besoin d&#39;un grand nombre d&#39;animaux afin d&#39;être considéré comme statistiquement significatif et entraînent souvent des taux élevés de morbidité et de mortalité critères d&#39;évaluation pour l&#39;identification de la protection immunitaire. Nous avons utilisé l&#39;imagerie in vivo des systèmes (IVIS) en conjonction avec une enzyme bioluminescente luciole progressivement suivre l&#39;invasion du système nerveux central (SNC) par un riencephalitic virus dans un modèle murin. En général, la maladie progresse relativement lentement, mais la réplication du virus est rapide, en particulier dans le système nerveux central, et peut conduire à une souvent une issue fatale. Suite à l&#39;infection intranasale des souris avec TC83-Luc, une souche atténuée du Venezuela virus de l&#39;encéphalite équine modifié pour exprime un gène de la luciférase, nous sommes en mesure de visualiser la réplication du virus dans le cerveau au moins trois jours avant l&#39;apparition des symptômes cliniques de la maladie. Utilisant invasion du SNC comme un critère clé de la maladie encéphalitique développement, nous sommes en mesure d&#39;identifier rapidement thérapeutique et la protection vaccinale contre TC83-Luc infection avant les symptômes cliniques. Grâce à la technologie IVIS nous sommes en mesure de démontrer le dépistage rapide et précis de la thérapeutique de médicaments et de vaccins, tout en réduisant le nombre d&#39;animaux et la morbidité.

Avec un virus génétiquement modifié, TC83-luciférase, nous avons vu une augmentation de la puissance du signal bioluminescent que la réplication du virus se déplace de la région nasale dans le SNC centrales (figure 1). En raison du taux élevé de réplication virale, nous nous attendons à de hauts niveaux de signal bioluminescent (figure 2A) dépendant du vecteur et de la réponse immunitaire des animaux au vecteur. On s&#39;attendre à ce signal d&#39;augmentation de continuer...

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In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d&#39;imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d&#39;identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l&#39;invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d&#39;identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles animaux actuellement utilisés. La capacité d&#39;utiliser des animaux individuels sur plusieurs points temporels assure aux besoins des animaux réduits, des coûts et de la morbidité globale pour les animaux utilisés assurer un moyen plus humain et plus scientifique de l&#39;étude des maladies.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K vues.  University of Texas Medical Branch. En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antivirau...

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...