Nous remercions les Drs Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Paré et Tovi Lehman pour une lecture critique des manuscrits. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros de la Division de la recherche intra-muros, l&#39;Institut national des allergies et maladies infectieuses, National Institutes of Health, et par le Programme national de recherche de base 973 de la Chine, # 2007CB513103. Nous remercions le NIAID intra-muros éditeur de Brenda Marshall Rae pour l&#39;assistance.

Techniques d&#39;asepsie doivent être appliquées à tous les matériaux qui seront administrés dans des animaux pour éviter l&#39;introduction involontaire d&#39;agents infectieux exogènes dans des souris qui peuvent confondre les résultats expérimentaux. 1. L&#39;infection de souris de laboratoire avec des parasites du paludisme au stade sanguin <ol><li> A température ambiante, le dégel deux flacons contenant les parasites du sang congelé stade de la malaria à franchir. Dans cet exemple, deux souches de rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii sont utilisés yoelii et Plasmodium yoelii nigeriensis. </li><li> Fit une seringue avec une jauge de 22 à 30 (G) l&#39;aiguille et d&#39;élaborer des 400 ul de stériles, des produits pharmaceutiques de qualité PBS (pH 7,4). </li><li> En utilisant la même seringue, tirer jusqu&#39;à 100 uL de sang infectés décongelés; inverser la seringue de haut en bas jusqu&#39;à ce que le contenu est mélangés de façon homogène. (Facultatif: une pipette peut être utilisé pour transférer du PBS et du sang infecté dans un tube de collecte avant d&#39;être transférés dans une seringue pour injection). </li><li> Injecter 200 ul de parasite contenant une solution directement dans le péritoine d&#39;une souris. Lorsque vous avez terminé, jeter la seringue dans une poubelle les objets tranchants. (Voir aussi Matières supplémentaires pour l&#39;entretien des souris de laboratoire). En général, la taille standard de l&#39;inoculum est entre 100-500 ul, selon les niveaux d&#39;infections parasitaires dans les documents originaux congelés. </li><li> Injecter les deux souches de parasites d&#39;être franchi dans deux souris chacun. Les souris deviennent positifs au microscope 3 à 5 jours après les injections. Lorsque parasitémies atteindre entre 1-5%, passez à l&#39;étape suivante. </li></ol> 2. Infection Clone mixte de Souris <ol><li> Avant l&#39;infection clone mixtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l&#39;examen microscopique par colorées au Giemsa des frottis sanguins minces (Fig. 3), et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées) . </li><li> Calculer le volume d&#39;un sérum physiologique (1,5% p / v citrate trisodique dihydraté, 0,85% de chlorure de sodium p / v) et le sang de souris nécessaire pour produire un mélange d&#39;inoculum, en utilisant la parasitémie et le rouge du sang des mesures de densité cellulaire obtenue plus tôt. </li><li> Ajuster la solution parasite à une concentration finale d&#39;un million de globules rouges infectés par 100 ul. </li><li> Combinez le sang infecté par les deux bailleurs de fonds dans un rapport 1:1 pour obtenir un inoculum mixte-clone. Lorsque les deux clones parentaux diffèrent du taux de croissance, d&#39;ajuster les proportions d&#39;un. Croissance rapide des parents à un clone à croissance plus lente des parents à 1:2 ou 1:5 </li><li> Injecter 100 ml de l&#39;échantillon mélangé dans le péritoine de chaque souris pour être infecté. (Voir aussi étape 3.9 pour déterminer le nombre de souris pour être injecté) </li><li> En utilisant cette méthode, infecter deux souris chacun avec les souches seul des parents. Les infections seul clone permettra de déterminer la transmission réussie des deux souches parentales. </li></ol> 3. Les moustiques alimentation <ol><li> Préparer trois cages contenant 300 à 500 adultes (hommes et femmes) Anopheles stephensi moustiques chacun, l&#39;âge émergence 5-7 jours après à partir de pupes. Les conteneurs sont recouverts de grillage sécurisé par un plastique ou un couvercle en métal. Deux cages sont à l&#39;alimentation sur les clones parentaux, la cage troisième est pour la préparation d&#39;un croisement génétique. </li><li> À partir quatre jours après l&#39;infection mixte-clone, préparer colorés au Giemsa minces frottis de sang de la queue de souris infectées. </li><li> Examiner les frottis au microscope à balayage par au moins 50 champs microscopiques à un grossissement de 1000x et déterminer si gamétocytes mâles et femelles sont présents. </li><li> Gamétocytes mâles et femelles sont reconnaissables en raison de la présence de gros granules et de grandes vacuoles (fig. 3). Gamétocytes mâles et femelles ont le cytoplasme rose et bleu, respectivement. Si gamétocytes sont présents, suivre l&#39;étape 3.6. </li><li> Si gamétocytes sont absents, garder un suivi quotidien jusqu&#39;à ce qu&#39;ils apparaissent. Si gamétocytes sont présents, continuent l&#39;étape suivante. </li><li> Injecter 50 ul de cocktail de médicaments anesthésiques contenant 33 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine dans le péritoine d&#39;une souris pour anesthésier chaque souris infectées (par 20 gramme de poids corporel de la souris). Dose finale de kétamine et de xylazine est de 82,5 et 7,5 mg / kg, respectivement. </li><li> Placez la souris à l&#39;envers sur le dessus d&#39;une cage contenant les adultes que les moustiques Anopheles stephensi ont été privés de l&#39;approvisionnement en sucre pendant 24 heures et permettre aux moustiques de se nourrir pendant 30 minutes sans interruption. </li><li> Maintenir les moustiques dans un insectarium dans des conditions standard (température est maintenue entre 24-26 ° C, voir également des méthodes supplémentaires pour l&#39;entretien du laboratoire de moustiques). </li><li> Utilisez une souris infectée par tous les 50-100 moustiques femelles. Euthanasier les souris immédiatement par dislocation cervicale après la tétée alors que les souris sont encore sous anesthésie. </li></ol> 4. Midg Mosquito dissectionuts et des oocystes de comptage <ol><li> Neuf jours après la tétée, les moustiques seront examinés pour des oocystes dans l&#39;intestin moyen des insectes. La présence d&#39;oocystes dans les moustiques qui se nourrissent sur un seul clone souris infectées indique que les gamétocytes des deux souches parentales sont infectieuses. </li><li> Pour disséquer un intestin des moustiques, l&#39;utilisation d&#39;un aspirateur relié à un petit récipient pour recueillir 5 à 10 moustiques infectés de la cage. </li><li> L&#39;utilisation du gaz CO 2, anesthésier les moustiques et les transférer dans un plat en verre de Pétri sur la glace. Séparée et jetez les moustiques mâles. Les antennes des mâles sont nettement plus touffu en comparaison avec les femelles. </li><li> Remplir deux seringues avec du PBS et les adapter aux calibre 26 demi-pouce (G ½) des aiguilles. Caution de 100 ul de PBS à partir d&#39;une seringue sur une lame de verre. </li><li> Transfert de 5 à 10 anesthésiés moustiques femelles sur la goutte de PBS et de placer la lame sur un microscope à dissection. </li><li> En utilisant la même aiguille, enlever les ailes de chaque moustique et les jambes, puis, tenant l&#39;insecte à l&#39;abdomen du thorax et postérieur, tirez le corps de l&#39;autre jusqu&#39;à l&#39;intestin moyen, un blanc en forme de sac du corps, est libéré. Détachez l&#39;intestin moyen et jeter le reste du corps. </li><li> Ajouter plus de PBS sur l&#39;intestin moyen, si les lames sont sèches. L&#39;intestin moyen va dégénérer si les laissez sécher. Placer une lamelle sur la estomacs. </li><li> Examiner les estomacs sous un microscope optique à un grossissement 100x. Comptez le nombre d&#39;oocystes dans chaque intestin moyen (Fig. 3). Les oocystes sont reconnaissables comme à paroi épaisse structures circulaires qui se trouvent sur la surface extérieure de la estomacs. </li><li> Lorsque vous avez terminé, jeter les seringues, aiguilles, et glisser dans une poubelle les objets tranchants. </li><li> Si les oocystes sont absents dans les estomacs, nourrir les moustiques avec des souris infectées avec le plus grand nombre de gamétocytes et donner un plus long temps d&#39;alimentation. La température est critique pour cette étape. Assurez-vous que la température est fixé à 24 à 26 ° C. </li></ol> 5. Collecte sporozoïtes de moustiques par centrifugation <ol><li> Préparer des tubes de prélèvement sporozoïte comme suit: couper le couvercle d&#39;un tube à centrifuger de 0,5 ml propre et percer un trou (0,1-0,2 mm de diamètre) au fond du tube en utilisant une aiguille de 19 G flambé. </li><li> Remplir 1 / 3 du tube avec de la laine de verre. Insérez le tube du filtre dans un tube de collecte de 1,5 mL (un tube est suffisante pour la récolte sporozoïtes de ~ 100 moustiques) </li><li> Sur l&#39;alimentation après 17 jours, de recueillir les moustiques (étape 4) de la cage dans un petit récipient à l&#39;aide d&#39;un aspirateur. </li><li> Utilisez gaz CO 2 à anesthésier les moustiques. </li><li> Séparez les femelles des moustiques mâles. Transférer les moustiques femelles anesthésiées par le conteneur pour un plat en verre de Pétri sur la glace. </li><li> Préparer deux seringues avec des aiguilles 26 G ½ remplis avec du PBS. Caution de 100 ul de PBS à partir d&#39;une seringue sur une lame de verre. </li><li> Transférer les moustiques sur une lame de microscope. Retirez la tête des moustiques, des ailes, des jambes et l&#39;abdomen sous un microscope à dissection. </li><li> En utilisant une pince à pointe fine transférer le thorax dans 0,5 ml de PBS dans un homogénéisateur de 1,5 mL (mortier et un pilon). Stocker le thorax sur glace (sporozoïte reste infectieux pendant 2-3 h). </li><li> Homogénéiser le thorax sur la glace pour libérer les sporozoïtes des glandes salivaires (voir Figure 3), et le transfert des lysats (broyats) dans le tube rempli de laine de verre (étape 5.1 à 5.2) en utilisant une pipette en verre. </li><li> Centrifuger pendant 10 à 20 sec à 1000 rpm à température ambiante. </li><li> Recueillir l&#39;écoulement continu (la suspension de sporozoïtes purifiés) à l&#39;aide d&#39;une seringue avec une aiguille de 22 à 30 G. (Facultatif: chute de 10 à 50 uL de l&#39;écoulement continu sur une lame de microscope, placer une lamelle et visualiser les sporozoïtes vivre sous un microscope optique standard, 400X grossissement, voir aussi Fig 3) </li><li> Injecter ip de 0,1 à 0,5 ml de la suspension de sporozoïtes chez des souris (jusqu&#39;à 200 000 parasites peuvent être récoltés à partir d&#39;un seul moustique, voir réf 12). Dans un cas de succès, l&#39;animal sera infecté 72 heures après une injection. </li></ol> 6. Progeny clonage en utilisant une dilution limitée <ol><li> Soixante-douze heures après les injections de sporozoïtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l&#39;examen microscopique après coloration de Giemsa de frottis sanguins minces et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées). </li><li> Choisissez une souris affichant une parasitémie 0,1 à 1% et dont les globules rouges infectés contiennent des parasites souvent seule en tant que donateur pour la procédure de clonage. Répétez l&#39;étape 6.1 prochains jours si les souris sont microscopiquement négatifs. Si les animaux ne sont pas infectés dans les 14 jours, répétez l&#39;étape 2 à 5 et de déterminer la présence de sporozoïtes dans l&#39;étape 5.11). </li><li> Diluer le sang de la queue récoltés dans un froid 1h01 solution de Ringer sérum de veau et de mammifères (2,7 mM de chlorure de potassium, chlorure de calcium 1,8 mM, 154 mM de chlorure de sodium) afin d&#39;atteindre un conconcentration de 0,6 à 1 globule rouge infecté par 100 ul, et de stocker l&#39;inoculum sur la glace. De cette manière, la plupart des souris individu doit recevoir soit un ou zéro parasites. </li><li> Par voie intraveineuse, injecter 100 ml de sang infecté diluée dans chaque de 50 à 100 souris. </li><li> Cinq à sept jours plus tard, l&#39;écran les souris de la présence de parasites au stade sanguin en examinant colorés au Giemsa des frottis sanguins minces. Dans une expérience réussie, 20-50% des souris infectées et montrera parasitémie de 0,1 à 5,0% à 8 jours après l&#39;infection. </li></ol> 7. Caractérisation de Progeny aide de marqueurs génétiques <ol><li> Recueillir 20 à 40 ul de sang de la queue de la souris dans un microtube de 1,5 ml contenant 0,2 ml de solution de citrate de sérum physiologique refroidi, brièvement au vortex et centrifuger 3 min à 3000 rpm à température ambiante pour obtenir un culot des cellules sanguines. Extraire l&#39;ADN immédiatement ou garder la pastille à -80 ° C. </li><li> Préparer l&#39;ADN du parasite en utilisant n&#39;importe quel des méthodes standard d&#39;extraction d&#39;ADN. Pour l&#39;isolation rapide de l&#39;ADN, utiliser un High Pure PCR préparation template kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Recombinant descendance sont identifiés après le génotypage à l&#39;aide de microsatellites (MS) ou single nucleotide polymorphism (SNP) sur différents chromosomes qui peuvent différencier les deux souches parentales de la croix génétique. Une méthode simplifiée utilisant une seule des amorces fluorescentes marquées pour MS génotypage de P. yoelii peut être utilisé (voir réf 8,9). </li></ol> 8. La cryoconservation des parasites du paludisme au stade sanguin <ol><li> Recueillir 0,5-1 ml de sang infecté par ponction cardiaque à partir d&#39;une souris anesthésiés avec une parasitémie de 5-20% 5-10 mL dans le sérum physiologique refroidi. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 2000 rpm à température ambiante. Rejeter le surnageant. </li><li> Ajouter goutte à goutte 2x volume de la solution de Glycerolyte 57 (Fenwal Laboratories) sur pastilles de sang et bien mélanger. </li><li> Transférer la suspension dans des cryotubes (0,2-0,5 ml par tube). </li><li> Stocker le sang cryoconservés à -80 ° C (jusqu&#39;à 1 mois) ou dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs: Dans une expérience réussie, 5-10% des lignes cloné sera indépendant progéniture recombinantes. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique du cycle de vie et des événements de recombinaison génétique lors d&#39;un croisement génétique. Événements de recombinaison génétique ont lieu durant la phase précoce de développement dans le moustique. Après la fécondation de &quot;haploïde&quot; gamètes mâles et femelles de différentes origines génétiques dans l&#39;intestin du moustique, &quot;diploïde&quot; zygotes sont formées. Le zygote diploïde constitue l&#39;étape seulement du cycle de vie du parasite; méiose suit dans les 12 heures de la fécondation, et toutes les étapes ultérieures dans le moustique et les mammifères restent haploïdes. Les zygotes résultant développer en ookinètes et des oocystes. La croissance et la division mitotique de chaque oocyste produit des milliers de sporozoïtes, qui sont libérées dans hemoceal moustiques. Ceux sporozoïtes qui migrent vers les glandes salivaires sont en position d&#39;être transmis à un hôte mammifère, où le développement du foie et rouge stades cellulaires du sang a lieu. Au cours des cycles de globules rouges, certains parasites peuvent se différencier en maturité gamétocytes mâles et femelles. Le cycle de vie du parasite est terminée lorsque ces gamétocytes sont repris par un autre moustique, la transmission perpétuer. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Héritage des gènes nucléaires des parasites du paludisme et de la production de la descendance recombinante. La recombinaison génétique peuvent être générés par réassortiment chromosomique ou par des événements croisé. Progéniture produite par autofécondation homozygote entre les gamètes d&#39;un même clone parental 1 ou 2 (A et D), respectivement. B) la descendance hétérozygote produit par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux différents clones parentaux, les noyaux recombinante (ovales bleu) étant formé par réassortiment chromosomiques seul. C) la descendance hétérozygote produit à partir de la fertilisation croisée entre les gamètes des deux clones parent différent, les noyaux recombinante (ovales rouge) étant formé par les croisements entre les chromatides non-sœurs des chromosomes homologues. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Morphologie du rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii. A) stade anneau, B) trophozoïte, C) schizonte, D) mérozoïtes, E) immatures gamétocytes mâle, F) gamétocytes mâles matures, G) immatures gamétocytes femelles, H) gamétocytes femelles matures, I) l&#39;intestin moyen avec des oocystes au jour 10 après l&#39;alimentation (oocystes matures indiquées par des flèches; 200x de grossissement), J) les glandes salivaires des moustiques (grossissement 100x), K) sporozoïtes (400x de grossissement).

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Nous démontrer les techniques pour la production d&#39;un croisement génétique chez le rongeur le paludisme à Plasmodium yoelii, qui est également applicable à la production des croisements génétiques dans les paludismes autres rongeurs. Infections des souris avec une seule clones parentaux sont généralement effectués pour déterminer la transmission réussie des parasites des parents pour s&#39;assurer que les parents sont compétents dans la production de gamètes fonctionnels avant d&#39;effectuer...

MATÉRIAUX SUPPLÉMENTAIRES: <ul><li> Entretien des souris de laboratoire </li><li> Entretien du laboratoire des moustiques </li><li> L&#39;examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa </li><li> Mesure de la densité des globules rouges </li></ul> Entretien des souris de laboratoire Les femelles de souche de laboratoire de souris consanguines BALB / c, âgés de 5 à 8 semaines, sont utilisées dans l&#39;étude. Les souris sont logées dans un standard solide fond de la cage en polycarbonate avec fil-bar couvercle, équipé d&#39;engraissement et une bouteille d&#39;eau. Les souris sont maintenus à une température constante (25 ± 1 ° C) sur 12:12 heures de lumière: le cycle noir. Les souris sont autorisés à se nourrir de 2018S Harlan Teklad mondiale régime protéiné rongeurs 19% extrudé (stérilisable; de ​​Harlan-Teklad) et fourni avec acidifiés potable de l&#39;eau ad libitum. Expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;utilisation à l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses en vertu du protocole LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Entretien du laboratoire des moustiques Les moustiques sont d&#39;une colonie de laboratoire de race Anopheles stephensi. Les adultes sont maintenus dans des cages en nylon maintenu à une température et humidité contrôlées ambiante (23 à 25 ° C pour le Plasmodium yoelii et Plasmodium chabaudi, et 19 à 21 ° C pour Plasmodium berghei, 80 à 95% humidité; le 12:12 heures de lumière: le cycle sombre). Les moustiques adultes sont nourris avec du glucose à 10% et 2,00% acide para-aminobenzoïque (PABA) une solution d&#39;eau complété. Pour obtenir de haute qualité aux adultes, 500 larves sont cultivées dans un état ​​de faible densité dans 1 L d&#39;eau distillée dans un 1000 cm 3-plat ouvert fourni avec environ 1 mg de bicarbonate de sodium. Après éclosion, les larves sont donnés TetraMin poudre (PETCO) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils développent dans le stade de pupe et sont transférés vers les cages de moustiques adultes pour les pays émergents. L&#39;examen microscopique des frottis sanguins minces colorés avec le colorant de Giemsa Avec des ciseaux propres coupez l&#39;extrémité (1,0 mm) de la queue de la souris infectée. Déposer une goutte (0,5-1,0 uL) de sang de la queue sur une lame de spécimen propre. La souris arrêter le saignement dans les 1-2 min. Placez une diapositive épandeur de nettoyage sur le dessus de la goutte de sang, son maintien à un angle de 45 ° par rapport à la diapositive échantillon, et permettre au sang d&#39;adsorption sur toute la largeur de l&#39;épandeur. Tenir la lamelle de préparation et de faire avancer la diapositive écarteur rapidement et en douceur pour produire un frottis mince. Laissez le film de sang sec, puis plonger les lames dans du méthanol absolu. Laisser la lame sécher à l&#39;air une fois de plus avant de le couvrir au Giemsa (10% de colorant Giemsa à l&#39;eau distillée). Après incubation des films minces de sang pendant 10-15 min à température ambiante, rincer soigneusement les lames avec de l&#39;eau du robinet et laissez sécher à l&#39;air. Examinez le nombre de globules rouges infectés (CISR; voir la figure 3 pour la morphologie des personnes infectées RBC) sous un microscope à lumière avec de l&#39;huile d&#39;immersion à un grossissement de 1000x (avec lentille de l&#39;objectif 100x) et calculer la parasitémie (le nombre d&#39;CISR par 100 RBC comptés). Différentes souches de parasites du paludisme varie en taux de croissance et la pathogénicité. Suivi des parasitémies stade sanguin peut être effectué 24 heures après les injections, en fonction de la dose de parasites du sang, le paludisme scène. Par exemple, les souris seront positifs au microscope 24 heures lorsqu&#39;il est injecté avec 10 7 infectées par voie intrapéritonéale RBC ou 10 6 infectées RBC par voie intraveineuse. Mesure de la densité des globules rouges Comme les niveaux de parasitémie, de globules rouges (RBC) de densité chez les souris infectées varie tout au long du cours de l&#39;infection. La densité de RBC doit être mesurée dans les 1-2 heures avant le début de l&#39;infection unique et mixte clone et les expériences de clonage. Il existe deux méthodes pour la mesure de la densité de RBC: un comptage manuel en utilisant Neubauer hémocytomètre et une de comptage automatique en utilisant un Cellometer (Nexcelom Bioscience). Dans les deux méthodes, retirer 1 pl de sang de la queue de la souris en utilisant un capillaire en verre (VWR) et diluer dans 10 ml de PBS et mélangez bien. Pour utiliser un hémocytomètre Neubauer, charge de 20 pi de la suspension sur le hématimètre. Placez le hématimètre sur un microscope optique avec objectif 10x. L&#39;hématimètre contient une grille divisée en 9 grandes places, et 4 grands carrés à l&#39;angle sont encore divisés en 16 petits carrés. Compter le nombre total de cellules dans chacune des 16 petits carrés dans les quatre cases de coin. Pour éviter de compter partialité ou le comptage des cellules qui se chevauchent une ligne de grille, comptez une cellule comme &quot;in&quot; s&#39;il recouvre les lignes haut ou à droite et &quot;out&quot; s&#39;il recouvre les lignes en bas ou de gauche. Estimer le nombre de cellules par une petite place et diviser par 0,00625 (le volume d&#39;un petit carré est de 6,25 nL). Cela donne le nombre de cellules par microlitre (&amp;mu, L). De ces données, calculer la densité de la finale de globules rouges en multipliant avec 10.000 (un facteur de dilution). Rincer la lamelle et chambre de comptage de l&#39;eau distillée et 70% d&#39;éthanol; l&#39;air sec. Sinon, charge de 20 pi de la suspension sur une lame de chambre Cellometer comptage. Insérez la lame dans une chambre de glisser Cellometer (le lecteur). Démarrez le logiciel Cellometer, sélectionnez l&#39;option &quot;globules rouges du sang&quot; option, puis entrez un facteur de dilution de 10 000. Enregistrement de la densité de RBC.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et dans la pathogénicité des parasites du paludisme est de l&#39;importance biologique et médicale. Cartographie de liaison a conduit à l&#39;identification réussie de gènes ou loci sous différents traits de parasites du paludisme des rongeurs 1-3 et humains 4-6. Le parasite du paludisme Plasmodium yoelii est l&#39;une des nombreuses espèces de paludisme isolé de rongeurs africains sauvages et a été adapté à croître dans les laboratoires. Cette espèce se reproduit de nombreuses caractéristiques biologiques des parasites du paludisme humain; marqueurs génétiques tels que des microsatellites et amplifié fragment length polymorphism (AFLP) ont également été développés pour le parasite 7-9. Ainsi, les études génétiques des parasites du paludisme des rongeurs peuvent être effectués pour compléter les recherches sur Plasmodium falciparum. Ici, nous montrons les techniques de production d&#39;un croisement génétique de P. yoelii qui ont d&#39;abord mis au point par les Drs. David Walliker, Richard Carter, et ses collègues de l&#39;Université d&#39;Edimbourg 10. Croisements génétiques de P. yoelii et autres parasites du paludisme chez les rongeurs sont menées en infectant les souris Mus musculus avec un inoculum contenant des gamétocytes de deux clones génétiquement distincts qui diffèrent dans les phénotypes d&#39;intérêt et en permettant aux moustiques de se nourrir de souris infectées quatre jours après l&#39;infection. La présence de gamétocytes mâles et femelles dans le sang au microscope de la souris est confirmée avant la tétée. Dans les 48 heures après le repas, dans l&#39;intestin moyen du moustique, les gamétocytes haploïdes se différencier en gamètes mâles et femelles, fertiliser, et forment un zygote diploïde (Fig. 1). Pendant le développement d&#39;un zygote dans un ookinète, méiose semble se produire 11. Si le zygote est dérivée par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux parasites génétiquement distinctes, les échanges génétiques (réassortiment chromosomiques et cross-overs entre les chromatides non-sœurs d&#39;une paire de chromosomes homologues;. Fig 2) peut se produire, résultant en une recombinaison du matériel génétique au locus homologue. Chaque zygote subit deux divisions successives nucléaires, conduisant à quatre noyaux haploïdes. Un ookinète développe davantage dans un oocyste. Une fois l&#39;oocyste mûrit, des milliers de sporozoïtes (la descendance de la croix) sont formés et libérés dans hemoceal moustiques. Les sporozoïtes sont récoltées à partir des glandes salivaires et injecté dans un nouvel hôte murin, où le développement stade pré-érythrocytaire et érythrocytaire a lieu. Formes érythrocytaires sont clonés et classés à l&#39;égard des caractères distinctifs des lignées parentales avant la cartographie de liaison génétique. Contrôle des infections de l&#39;individu clones parentaux sont effectuées de la même manière que la production d&#39;un croisement génétique.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Et est applicable à d&#39;autres parasites du paludisme chez les rongeurs.

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K vues.  National Institutes of Health. Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques Plasmodium yoelii Et est applicable à d'autres parasites du paludisme chez les rongeurs.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...