Les auteurs tiennent à remercier Miriam Ester pour la reproduction des moustiques. Ce travail a été soutenu par un financement interne du Centre de recherche Borstel et rejoint le financement par l&#39;infection Leibniz Center.

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. 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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Nous avons décrit comment les souris peuvent être productive infectées par le Vtt et P. berghei par leurs voies naturelles de l&#39;infection. Nous appliquons des protocoles établis d&#39;infection à étudier la tuberculose ou le paludisme expérimental 13 12 et les a récemment adopté pour étudier la co-infection entre Vtt et Plasmodium dans le modèle de la souris 1. Les étapes les plus critiques pour les infections de succès sont la transmission de ces deux agents pathogènes dans les chiffres désirés. Les stocks de mycobactéries ne devraient pas être plus de 2 ans, car ils perdront la viabilité dans le temps, et le titre initialement déterminé des stocks seront très probablement ne plus être exactes. En conséquence, des doses d&#39;infection, il est beaucoup plus faible que prévu. Par conséquent, les titres UFC de cultures mères devraient être déterminés tous les quelques mois. Tout aussi important est la culture standardisée et la production des stocks vtt en premier lieu. Les conditions de culture telles quemoyenne, les suppléments, l&#39;heure et le volume doivent être normalisées afin de pouvoir comparer les données des expériences en utilisant différents stocks de Vtt. Les mycobactéries ont tendance à s&#39;agglomérer au cours de la culture, il est donc important de maintenir des conditions de culture standardisées, des bactéries de la récolte à la même phase de croissance et de remettre en suspension au cours de l&#39;aliquotage fréquemment. Sinon, il peut y avoir une grande variation dans les titres UFC et issue de l&#39;infection. La génération de lots de moustiques infectés de façon homogène est une autre étape critique. Depuis différentes moustiques se nourrissent de chaque souris individuelle, il est important que tous les moustiques utilisés pour une expérience d&#39;infection proviennent du même lot et que seuls les lots où plus de 90% des moustiques sont infectés sont utilisés. Le modèle actuel peut être utilisé pour disséquer les réponses immunitaires et des modulations immunitaires chez un hôte co-infecté par le comparant à des réponses immunitaires chez des hôtes infectés simples. Nous pouvons appliquer vaRious méthodologies bien établies telles que l&#39;histologie, immunohistochimie, l&#39;analyse par cytométrie de populations de cellules immunitaires, ou PCR et ELISA pour la détection des cytokines et des chimiokines aux fluides corporels ou de tissus d&#39;intérêt. Il est à noter, que de tels modèles de souris ont certaines limites. Alors que la majorité des personnes infectées par Mtb développer une infection latente sans aucun signe de symptômes cliniques, les souris développent une maladie chronique avec une pathologie pulmonaire progressive. Pourtant, C57BL / 6 sont relativement résistantes à l&#39;infection Vtt et ne développent pas de granulomes classiques comme observé chez les patients tuberculeux humains. En conséquence, les réactions immunopathologiques chez la souris ne reflètent pas une maladie latente, ni la tuberculose humaine actif de manière appropriée. Malgré l&#39;écart entre la maladie latente et chronique chez l&#39;homme et la souris, les souris ont été largement utilisés pour identifier et étudier les facteurs de l&#39;hôte qui contrôlent l&#39;infection Vtt et sont des outils précieux et indispensables pour enquêterles réponses immunitaires dans les maladies infectieuses. Surtout, la susceptibilité aux infections Vtt varie considérablement entre les souches de souris consanguines couramment utilisés et les souches les plus sensibles tels que DBA ou C3H peuvent être inclus dans les études co-et mono-infection. Par ailleurs, outre les espèces de pathogènes décrits ici, toutes les autres espèces de Mycobacterium présentant un intérêt (par exemple des isolats cliniques) pourraient être utilisés. De même, si aucun modèle de paludisme simple réplique tous les aspects des modèles différents de souris de la maladie humaine ne ressemblent étroitement les différents aspects de l&#39;infection du paludisme humain naturellement acquise. Par exemple, P. berghei ANKA et P. yoelii YM/17XL sont largement étudié les modèles de l&#39;homme (P. falciparum induit) de paludisme grave, avec P. berghei ANKA étant considéré comme un excellent modèle pour l&#39;homme Malari cérébrale de 14,15. P. berghei NK65 est un excellent modèle pour hyperparasitémie et anémie palustre aiguë, et a récemment étédécrit comme un modèle expérimental du syndrome associé au paludisme aigu de détresse respiratoire (SDRA MA-16). En utilisant le modèle de la co-infection décrite, nous pourrions montrer que récemment concurrente P. infection berghei NK65 aggrave la tuberculose chronique 1. Outre l&#39;utilisation de différents parasites du paludisme des rongeurs, l&#39;ordre et le calendrier des événements d&#39;infection peuvent être adaptés en fonction de la question de recherche sous-jacente. Sur le terrain, les infections de Plasmodium concomitants peuvent être présents au moment de l&#39;infection Vtt ou acquis par la suite. Dans les deux scénarios, les réponses immunitaires à Vtt et Plasmodium peuvent être affectés différemment. Par conséquent, les souris peuvent être infectées avec des sporozoïtes de Plasmodium soit avant ou après l&#39;infection par Mtb. En outre, les souris peuvent être contestées à différents moments après l&#39;infection Vtt pour évaluer l&#39;impact de la réponse immunitaire induite par Plasmodium-aiguë ou chronique surtuberculose. Il est important, lors du choix d&#39;un parasite du paludisme pour étudier le paludisme-tuberculose co-infection, il faut être conscient que certaines souches de Plasmodium de rongeurs causent la maladie aiguë dans certaines souches de souris et succombent à l&#39;infection au sein de quelques jours ou semaines tout en Vtt provoque les infections chroniques et de longue durée dans immunocompétent les souris. Par conséquent, le calendrier de la co-infection est essentielle pour éviter la mort prématurée d&#39;animaux de laboratoire. La modulation de l&#39;immunité de l&#39;hôte par une infection simultanée avec des espèces de pathogènes multiples reste mal comprise. Notre modèle de co-infection expérimentale fournit un outil puissant pour étudier Mycobacterium - Plasmodium interaction avec le système immunitaire d&#39;un hôte co-infectés et contribuera à notre compréhension comment les co-infections peuvent affecter la pathogenèse, évolution de la maladie, la vaccination, immunodiagnostics, et la thérapie.

Les populations humaines sont rarement exposés à un agent pathogène seulement. En particulier dans les régions à forte incidence d&#39;infections telles que l&#39;Afrique sub-saharienne, les co-infections représentent un problème de santé publique prime mais très sous-estimé. La tuberculose et le paludisme sont des infections bactériennes et parasitaires les plus répandues chez l&#39;homme, respectivement, et continuent d&#39;être les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Malgré le large chevauchement géographique entre la tuberculose et le paludisme et le grand nombre de personnes à risque de co-infection, on sait très peu sur les interactions entre les différents et souvent contrecarrant les régulateurs et effecteurs immunitaires induites simultanément contre les parasites du paludisme et les bacilles tuberculeux co-infectés individus. modèles de rongeurs d&#39;infections mixtes permettent de caractériser les réactions immunitaires différentiels contre les agents pathogènes distincts dans un hôte, perdant ainsi en lumière la mutuelle influencerences moduler la pathologie et les résultats cliniques de la maladie individuelle, ce qui contribuera également à identifier de nouvelles recommandations pour le traitement et la prévention. Nous avons établi un modèle expérimental chez la souris qui nous permet d&#39;étudier les conséquences causées par une infection concomitante par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et les espèces de Plasmodium de rongeurs dans le même hôte 1. Il est important, pour émuler des infections humaines naturellement acquis aussi étroitement que possible, notre modèle met en œuvre les voies naturelles d&#39;infection utilisés par les deux agents pathogènes. La tuberculose est une infection par voie aérienne, qui se manifeste donc principalement dans les poumons. L&#39;agent causal, Vtt est transmis par des personnes ayant une maladie active par voie d&#39;aérosol quand ils expulsent des gouttelettes infectieuses d&#39;aérosols lors de la toux ou les éternuements. Ainsi, l&#39;infection de l&#39;aérosol est la méthode de choix pour imiter une infection naturelle. Génération de particules en suspension qui contiennent Mtb peut être obtenue par l&#39;utilisationd&#39;un système d&#39;exposition par inhalation. Toute cette chambre d&#39;exposition du corps permet d&#39;exposer les animaux de laboratoire à Vtt contenant infectieuses gouttelettes d&#39;aérosol (figure 1) qui sont inhalées dans les alvéoles des poumons où l&#39;infection est initiée 2. Paludisme d&#39;autre part est une maladie à transmission vectorielle causée par le protozoaire, apicomplexe parasite Plasmodium qui est transmis naturellement par la piqûre d&#39;un moustique anophèle femelle. Pendant le repas de sang, les sporozoïtes infectieux sont déposés sous la peau de l&#39;hôte et atteindre ensuite le foie via la circulation sanguine. Dans les hépatocytes ils développent et se multiplient rapidement dans schizontes stade hépatique. Finalement, schizontes matures se rompent et libèrent des milliers de pathogènes mérozoïtes de première génération dans le sang où ils initient un cycle progressif de l&#39;invasion des globules rouges, la réplication, la rupture des globules rouges, et une nouvelle invasion 3. Le Contin du cycle de vie de Plasmodiumues que certains mérozoïtes se développent dans les stades parasitaires sexuels, les hommes et les femmes gamétocytes, qui peuvent être prises par les moustiques pendant les repas de sang. Dans le moustique, Plasmodium sporozoïtes se développent dans les oocystes résidant dans l&#39;intestin moyen de moustiques et finalement migrent vers les glandes salivaires pour transmission ultérieure dans un autre 3,4 hôte. Alors que dans les modèles animaux expérimentaux la livraison de VTT par l&#39;aérosol et itinéraire ainsi plus pertinent est très commun, de nombreuses études d&#39;infection rongeur de Plasmodium expérimentales y compris des études sur le paludisme-tuberculose co-infection 5-7 ont été effectués en infectant des souris avec des hématies parasitées, donnant lieu à l&#39;infection du paludisme au stade sanguin tout en excluant la phase cliniquement silencieuse stade hépatique. Cependant, l&#39;étape de foie est une étape obligatoire lors de l&#39;infection et pertinentes pour l&#39;immunité anti-Plasmodium 8-11. Nous considérons qu&#39;il est donc important d&#39;inclure le ph hépatiquease de la transmission du paludisme et de la maintenance dans les études de paludisme et de la tuberculose paludisme co-infection, respectivement. En outre, il a été montré que les sporozoïtes sont transmises naturellement plus contagieux que celles qui sont transmises par l&#39;intermédiaire d&#39;infections de l&#39;aiguille 12, ce qui nous a incité à établir l&#39;infection de la malaria par piqûre de moustique au lieu d&#39;injecter isolé des glandes salivaires dérivés des sporozoïtes. La seule façon d&#39;obtenir les moustiques infectieux pour la transmission naturelle de parasites du paludisme est de maintenir l&#39;ensemble du cycle de vie du parasite dans l&#39;hôte vertébré (ici de la souris) et le moustique vecteur. Ainsi, l&#39;accès à un insectarium pour la maintenance du parasite est inévitable afin d&#39;effectuer la transmission naturelle par morsure. Notre protocole décrit ici a été développé pour étudier comment la co-infection par Plasmodium sporozoïtes impacts sur la tuberculose chronique 1. Pour ce faire, les souris sont infectées par aérosol M. la tuberculose et 40 jours plus tard, lorsque M. infection de la tuberculose a atteint la phase chronique, les souris sont exposées à des moustiques vecteurs du paludisme infectieuse. Le résultat de la malaria et la tuberculose à la fois chez les animaux co-infectés peut être suivie en surveillant la parasitémie sanguine et de la charge bactérienne dans les tissus, respectivement. Dans notre protocole, nous allons décrire en détail comment infecter des souris avec les deux agents pathogènes par l&#39;intermédiaire de leur voie d&#39;infection naturelle et la façon de confirmer la transmission d&#39;agents pathogènes succès. Dans nos mains, le taux d&#39;infection atteint couramment pour les infections expérimentales est de 100%. Ces protocoles peuvent être appliqués à l&#39;étude des infections ou séparément, comme nous le faisons, pour modéliser et étudier la co-infection entre deux des maladies infectieuses humaines les plus difficiles. Ce modèle est applicable à d&#39;autres espèces de Mycobacterium et rongeurs Plasmodium au-delà de celles qui sont décrites dans ce protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Les co-infections se produisent naturellement en raison du chevauchement géographique des différents types de micro-organismes pathogènes. Infections concomitantes plus susceptibles de moduler la réponse immunitaire respective de chaque agent pathogène unique et peuvent de ce fait influer sur la pathogenèse et le résultat de la maladie. Patients co-infectés peuvent également répondre différemment aux interventions anti-infectieux. La co-infection entre la tuberculose causée par des mycobactéries et le parasite du paludisme Plasmodium, qui sont tous deux coendemic dans de nombreuses parties de l&#39;Afrique subsaharienne, n&#39;a pas été étudiée en détail. Afin d&#39;aborder le difficile, mais scientifiquement et cliniquement question très pertinente comment le paludisme-tuberculose co-infection moduler l&#39;immunité de l&#39;hôte et au cours de chaque maladie, nous avons établi un modèle expérimental chez la souris qui nous permet de disséquer les réponses immunitaires induites à la fois des agents pathogènes chez l&#39;hôte co-infectés . Il convient de noter, pour la plupart des infections humaines précisément imiter naturellement acquis, nous effectuons expérimentalinfections de la souris avec les deux agents pathogènes par leurs voies naturelles de l&#39;infection, à savoir aérosol et piqûre de moustique, respectivement.

L&#39;infection des souris avec Vtt et P. berghei par la voie naturelle, à savoir aérosol et piqûre de moustique, respectivement, les résultats de l&#39;infection constante et reproductible de tous les animaux (tableau 1) 1. Nous pouvons surveiller infection réussie et au cours des deux paludisme et la tuberculose en déterminant l&#39;apparition initiale (prépatence) et le nombre de parasites dans le sang (P. berghei parasitémie) et la charge de VTT dans les différents organes, respectivement. Un exemple de transmission réussie du parasite du paludisme par piqûre de moustique infectieux est montré dans le tableau 1 et la figure 3. Alimentation de 10 moustiques infectés de sporozoïtes sur chaque souris a entraîné un taux d&#39;infection de 100% comme l&#39;a confirmé la présence de parasites au stade sanguin 4-5 jours plus tard (tableau 1 et la figure 3A). Surtout, nous trouvons nombre de parasites similaires dans le sang des souris individuelles de la même gr expérimentaloup, indiquant que sporozoïte transmission par les résultats de morsures de moustiques dans une infection constante et reproductible. En comparant la prépatence chez les souris témoins naïfs avec celui des animaux de Vtt co-infectés, nous pouvons voir que prépatence est légèrement retardée chez les souris qui avaient été preinfected avec Vtt (tableau 1, figure 3B) 1. Comme nous l&#39;avons indiqué précédemment 1, nous pouvons déterminer l&#39;impact de la co-infection Vtt sur ​​le cours du paludisme par la parasitémie de suivi quotidien dans les frottis sanguins colorés au Giemsa comme le montre la figure 3B. L&#39;infection des souris avec Mtb par l&#39;utilisation d&#39;un résultat de système d&#39;exposition par inhalation de dépôt réussie des bactéries dans les poumons est relativement faible variabilité entre les souris individuelles (Figure 4A). Nous pouvons suivre charges de mycobactéries dans les poumons et d&#39;autres organes d&#39;intérêt au fil du temps par la détermination UFC. Un exemple de la charge mycobactérienne dans les poumons d&#39;Vtt infecté souris C57BL / 6 en l&#39;absence ou en présence de P. berghei est représenté sur la figure 4B. Tableau 1. Prépatence après la transmission de sporozoïte par piqûre de moustique. Toutes les souris ont développé des infections au stade sanguin après la transmission naturelle de P. berghei sporozoïtes par piqûre de moustique. Adapté de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Groupe expérimental chez la souris (C57BL / 6) </td><td> Contester par 10 piqûres infectantes de moustiques </td><td> Nombre de stade sanguin positif animaux / Nombre d&#39;animaux par groupe </td><td> Prépatence moyenne [d] </td></tr><tr><td> naïf </td><td> P. berghei </td><td> 7.7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Vtt infecté </td><td> P. berghei </td><td> 7.7 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Figure 1. Économie générale de la procédure expérimentale. Souris C57BL / 6 sont exposés à Vtt contenant des gouttelettes d&#39;aérosol dans une chambre d&#39;aérosol Glas-Col. Un jour après l&#39;infection par aérosol, l&#39;absorption de Vtt est vérifiée par analyse CFU du poumon. 40 jours après l&#39;épreuve de VTT (quand la tuberculose est devenue chronique chez des souris infectées), les animaux sont exposés à P. berghei moustiques infectés. Pour confirmer la transmission de sporozoïte succès et de suivre l&#39;évolution de l&#39;infection à Plasmodium, la parasitémie est surveillé quotidiennement dans les frottis sanguins colorés au Giemsa à partir 3 jours après une piqûre de moustique. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Croquis d&#39;une cage de moustique. Moustiques infectieuses sont contenus dans un carton comme une crème glacée carton demi-pinte. Une petite ouverture est découpée dans le côté de la boîte en carton et recouverte d&#39;une double couche de latex avec une fente découpée dans chaque pièce afin de créer une entrée sécurisée pour les moustiques. Un morceau de papier filtre est collé sur le fond intérieur de la boîte en carton pour absorber les gouttes. tasses de crème glacée sont fermés par des filets (filet de nylon) qui est fixé sur le carton par bande et la bande élastique. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> Figure 3. parasitémie dans le sang. A) Exemple de `s Wright teinté frottis sanguin montre hématies parasitées (de la barre d&#39;échelle, 20 &amp; #181;. M) B) parasitémie dans le sang de la souris a été suivie par l&#39;analyse quotidienne des frottis sanguins colorés au Giemsa. Une co-infection des souris ont une parasitémie réduite par rapport à des souris infectées par Plasmodium individuelles (n = 10); résultats sont présentés en tant que moyenne ± écart-type; *** p &lt;0.001. Reproduit de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> Figure 4. Détection de VTT dans le poumon. C57BL / 6 ont été aérosol contesté avec 100 UFC de VTT et 40 jours plus tard, une co-infection avec P. B) Les bactéries berghei par piqûre de moustique. A) Un jour après l&#39;infection par aérosol la captation du nombre souhaité de Mtb a été vérifiée par placage homogénats de poumon entier pour la détermination de CFU.l Les charges au moment de la co-infection ont été déterminées dans des lysats de poumon de 3 souris par analyse de CFU (Mtb de d40/d0). 12 jours après la co-infection, lysats pulmonaires ont été étalées pour l&#39;analyse UFC afin de déterminer l&#39;impact de la co-infection à Plasmodium sur le contrôle Vtt. Notez que le nombre vtt dans les poumons a augmenté pendant la co-infection avec P. berghei NK65. L&#39;étiquetage de l&#39;axe X: temps après Vtt -infection/time après la co-infection. Adapté de 1 PLoS ONE, 7 (10), avec la permission e48110.

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l&#39;épreuve avec les deux agents pathogènes par l&#39;intermédiaire de leur voie naturelle de l&#39;infection.

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K vues.  University Hospital Heidelberg.  La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection. 

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Recherche

Immunologie et infection

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infection modèle pour étudier<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification de puces à ADN

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Une nouvelle approche microdissection de la récupération<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Transcriptions spécifiques de formol paraffine fixe embarqué poumon granulomes

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Imagerie de Mycobacterium tuberculosis chez la souris avec la journaliste Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...