Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Nous tenons à remercier Darwin Accrochez pour son aide technique.

Déclaration utilisation des animaux: Les animaux ont été soignés conformément aux directives décrites dans le Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, en utilisant des protocoles approuvés par l&#39;Université du Minnesota de soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation. 1) Préparation des solutions <ol><li> Avant d&#39;effectuer l&#39;enregistrement électrophysiologique, des solutions intracellulaire, extracellulaire, et l&#39;enzyme besoin d&#39;être préparés. </li><li> Solution extracellulaire: mélanger une bouteille (8,8 g) de milieu de poudre d&#39;Ames (Sigma) avec 1 l de H 2 O et 1,9 g de bicarbonate de sodium (23 mM). À tous les points de la solution extracellulaire est saturé avec 95% O 2 / 5% mélange de gaz CO 2. Transfert de 200 mL dans un bécher de stockage rétine. Placer la solution restant dans le récipient système de perfusion pour la perfusion par gravité une fois de la rétine est monté. </li><li> Solution intracellulaire: solution intracellulaire doit avoir été faite précédemment, puis répartie dans 500-1000 aliquotes et conservés à -20 ° C. Solution intracellulaire varie en fonction de l&#39;expérience nécessaire, pour les enregistrements de pince de courant montré ici que nous utilisons (en mM): 125 K-gluconate, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP le pH à 7,2 avec KOH 5. Un traceur fluorescent tel que 10 uM AlexaFluor-594 hydrazide (Invitrogen) peuvent être ajoutées pour visualiser dendrites pendant l&#39;expérience, et neurobiotin (0,3%) peuvent également être inclus dans l&#39;analyse de l&#39;anatomie cellulaire après l&#39;enregistrement. Lorsque vous êtes prêt à enregistrer, le dégel solution intracellulaire. </li><li> Solution enzymatique: Combiner 10000 unités collagénase (substances chimiques Worthington) avec 83 mg de hyaluronidase (substances chimiques Worthington) dans 4.150 ml de solution extracellulaire. Boutique en 50 aliquotes à -20 ° C. Aliquotes peuvent être utilisées pendant plusieurs semaines. Lorsque vous êtes prêt à traiter la rétine, diluer aliquote dans 500 uL de solution extracellulaire barbotage. </li><li> Solution tamponnée au phosphate (PBS): dans 800 ml de H 2 O ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na 2 HPO 4 et 0,24 g de KH 2 PO 4. Amener le pH à 7,4 avec NaOH. Réglez le volume à 1 L. </li><li> Tampon phosphate 0,2 M: Dans 800 ml de H 2 O ajouter 21,8 g de Na 2 HPO 4 et 6,4 g de NaH 2 PO 4. Amener le volume à 1 L. </li><li> Solution de paraformaldéhyde à 4%: Chauffer 50 ml H 2 O à 60 ° C. Ajouter paraformaldéhyde 4g, remuez pendant quelques minutes. Ajouter quelques gouttes de NaOH 1M (environ 5 gouttes), continuer à remuer jusqu&#39;à ce qu&#39;une solution soit claire. Ajouter 50 ml tampon phosphate 0,2 M dans un bécher. Vérifiez le pH en utilisant des bandes de pH (~ 7,4). Filtrer et refroidir. </li><li> Solution de blocage (sérum de chèvre 10%, 0,5% TritonX100): dans 1,8 ml de PBS, ajoutez 0,2 ml de sérum de chèvre et 10 uL de Triton X-100. TritonX-100 sert à permeabilise le tissu. </li><li> Streptavidine solution (sérum de chèvre 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidine 594): Dans 1,9 ml de PBS ajouter 0,1 ml de sérum de chèvre, 10 uL Triton X-100 et 4 pi de streptavidine 594. </li></ol> 2) Isolement de la rétine de souris Des outils de dissection nécessaire: 1 # 2 pinces, 2 # 5 pinces, ciseaux ophtalmologique <ol><li> Euthanasier la souris selon des protocoles approuvés, dans ce cas d&#39;asphyxie CO 2 et du globe oculaire énucléer en insérant doucement une pince à angle # 2 derrière l&#39;œil et soulevant le globe oculaire. </li><li> Placez le globe oculaire dans un plat de Pétri de 35 mm avec une solution extracellulaire. Couper le nerf optique et tout muscles extraoculaires attachés ou du tissu conjonctif avec des ciseaux ophtalmologique. Coupez la cornée avec un ciseau ophtalmologiques et tirez la lentille en utilisant une pince # 5. Déchirez la sclère avec une paire de pince n ° 5 et l&#39;utilisation de la pince pour couper le nerf optique, où la rétine et la sclère rencontrer au disque optique. Décoller doucement la rétine loin de l&#39;œilleton. Astuce: Ne chaque étape sur les deux rétines avant de passer à l&#39;étape suivante afin de minimiser le temps. </li><li> Utilisez une pince pour enlever vitreuse attaché à la rétine. Ceci peut être réalisé par &quot;attraper&quot; le vitré transparent au-dessus de la rétine avec une pince. Le vitré, si supprimé avec succès, devrait être visible comme une substance transparente et gélatineuse sur la pince. Astuce: Trancheuse rétines de moitié après l&#39;enlèvement du corps vitré permettra de maximiser la quantité de tissu utilisable et faire monter dans la chambre de plus facile. </li><li> Gardez les rétines en solution extracellulaire oxygénée à la température ambiante dans un environnement sombre avec la lumière ambiante minimale jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à être digéré. Rétines peuvent être stockées de cette façon pour ~ 6 heures. </li></ol> 3) Le traitement de la rétine avec le mélange d&#39;enzymes et de montage dans la chambre d&#39;enregistrement <ol><li> Diluer une aliquote de la collagénase / hyaluronidase dans 500 uL solution extracellulaire, la solution de placer dans un plat de Pétri de 35 mm et le transfert de la rétine. </li><li> Gardez-la rétine contientING boîte de Petri, couverts et dans les ténèbres, dans une O2 95% / 5% CO 2 l&#39;environnement pendant 15 min avec agitation douce. Cette étape aides dans la digestion des corps vitré restant et permet de faciliter l&#39;accès à la couche des cellules ganglionnaires. Astuce: pour rétines des animaux plus jeunes avec moins vitreux ou si des effets indésirables observés sont, le temps peut être réduit à environ 5 minutes. </li><li> Retirez la rétine à partir d&#39;enzymes contenant du milieu et laver abondamment dans la solution extracellulaire </li><li> Transfert de la rétine dans l&#39;enregistrement de chambre 6 avec la couche des photorécepteurs vers le bas. Évacuer liquide restant avec soit une pipette ou de tissus et de déployer les côtés de la rétine pour aplatir le tissu en faisant attention de ne toucher que les bords de la rétine, en particulier en évitant le contact avec la couche de cellules ganglionnaires. Placer un anneau de platine avec plus de filet de nylon rétine pour ancrer les tissus et immédiatement remplir la chambre avec une solution extracellulaire. </li><li> Montez la chambre de l&#39;enregistrement sur la platine du microscope, fixez le tube de perfusion par gravité et aspiration sous vide et fixez le fil de terre. </li></ol> 4) la localisation des cellules ganglionnaires EGFP exprimer et la stimulation lumineuse <ol><li> Perfuser la rétine par gravité avec une solution à des taux extracellulaires mL / min ou plus rapide 1. Astuce: Si le taux de perfusion est trop lent, le tissu ne sera pas suffisamment oxygéné et de signalisation synaptique peut être perturbé. </li><li> Remplir une pipette d&#39;enregistrement avec une solution intracellulaire et l&#39;insérer dans le porte-pipette. Astuce: Pipettes avec des résistances de l&#39;ordre de 3 à 5MΩ donnent les meilleurs résultats. </li><li> Visualisez la rétine dans l&#39;infrarouge contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) optique à faible grossissement (objectif 10X, NA 0,3) pour localiser la pipette d&#39;enregistrement. La lumière infrarouge est utilisée pour minimiser l&#39;exposition rétine à la lumière visible et de minimiser adaptation à la lumière. Déplacer vers un plus fort grossissement (objectif 40X, NA 0,8) et amener l&#39;électrode dans la vue juste au-dessus du tissu. </li><li> A fort grossissement (objectif 40X), illuminent la rétine avec épifluorescence (480 nm pour EGFP) et sélectionnez une cellule ganglionnaire fluorescentes et marque sur écran d&#39;ordinateur à l&#39;aide de bande (figure 1A). </li><li> Sous l&#39;éclairage DIC et infrarouge, la position de l&#39;électrode d&#39;enregistrement à proximité de la cellule ganglionnaire ciblés (figure 1A). Nettoyer la zone couvrant la cellule immédiatement en appliquant une légère pression positive à l&#39;électrode d&#39;enregistrement via une seringue en plastique 12cc connecté au détenteur de pipette avec des tuyaux en polyéthylène. Sur l&#39;amplificateur, zéro tous les décalages de tension. Placer sur l&#39;électrode de cellules ganglionnaires sélectionné jusqu&#39;à une fossette apparaît sur la surface cellulaire. </li><li> Avec l&#39;amplificateur en mode voltage imposé, appliquer une impulsion de test et de suivre le courant passant dans la pipette. Appliquer une pression négative pour créer l&#39;étanchéité entre l&#39;électrode et la cellule. Communiqué de pression négative lorsque la cellule commence à sceller et d&#39;attendre la tenue actuelle est révélatrice d&#39;un sceau GQ électrique entre la membrane cellulaire et la pipette. Appliquer des impulsions douces de pression négative jusqu&#39;en transitoires capacitifs apparaissent, puis relâchez toute application d&#39;une pression. Astuce: si l&#39;accès (série) la résistance est élevée (&gt; 30MΩ), ce qui peut souvent être amélioré par d&#39;autres, très doux, des impulsions de pression négative. </li><li> Une fois un joint stable a été atteint appliquer une impulsion de pression négative. Après le mode cellule entière est obtenue, permettant d&#39;adapter la cellule à l&#39;obscurité pendant 5 minutes. Enregistrement, en mode courant imposé, la réponse à plein champ, la stimulation de lumière blanche (figure 1B). </li><li> Après l&#39;enregistrement, AlexaFluor-594 aura diffusé aux dendrites. Le traceur peut être visualisé sous épifluorescence à 594 nm et utilisé pour déterminer si une cellule ganglionnaire est en, hors, ou bi-stratifié par commutation entre épifluorescence et DIC optique infrarouge 5. </li><li> Si neurobiotin est inclus dans la pipette et de la rétine va être traitée pour l&#39;immunohistochimie, puis la pipette doit être délicatement retiré de fournir un minimum de perturbations de la membrane. </li></ol> 5) L&#39;analyse de l&#39;anatomie des cellules ganglionnaires enregistrées Remplissage avec neurobiotin permet plus de l&#39;analyse morphologique détaillée des cellules ganglionnaires après l&#39;enregistrement. Astuce: Si les corrélations spécifiques entre une cellule ganglionnaire enregistrées et la morphologie détaillée est souhaitée, il peut être préférable d&#39;enregistrer et de remplir un seul CJR par préparation. <ol><li> Si neurobiotin a été inclus dans la solution intracellulaire puis placer la rétine dans une solution de paraformaldéhyde et de fixer une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer avec du PBS, au moins 2 heures, au moins 6 changements. Transfert de la rétine à une plaque contenant une solution de blocage. Laissez-les dans une solution de blocage pendant 2 heures, la température ambiante sur agitateur. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec la solution de streptavidine. Incuber 2 jours à 4 ° C sur agitateur. Rincer la rétine dans le PBS, 6 rinçages, 20 min chacun. </li><li> Montez la rétine avec Vectashield dans une lame de verre.La rétine doit être placé avec les cellules ganglionnaires place. Effectuer la microscopie confocale (figure 1C). </li></ol> Les résultats représentatifs Si la rétine est saine et la dissection a été un succès, les cellules ganglionnaires individuelles devraient être visibles sous DIC à fort grossissement (figure 1A). Rétines malsain aura gros noyaux granulé et devraient être jetés. Si la réponse synaptique des cellules ganglionnaires une donnée est intacte, alors la cellule doit répondre à l&#39;apparition de lumière ou de compenser avec des potentiels d&#39;action et, dans le cas d&#39;une cellule ganglionnaire intrinsèquement photosensibles (figure 1B), une dépolarisation soutenue. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Localisation, d&#39;enregistrement et de la coloration d&#39;une cellule ganglionnaires de la rétine marqué par fluorescence (A). GFP CJR positifs visualisés sous un éclairage à un grossissement de 40X à épifluorescence (à gauche) et sous un éclairage DIC (à droite). (B) réponse à la lumière d&#39;une cellule de Synaptic M2 ganglionnaires intrinsèquement photosensibles rétine enregistrée dans la cellule entière mode courant imposé par RGC marquées par fluorescence. (C) M1 cellules ganglionnaires de la rétine intrinsèquement photosensibles qui a été identifié sous épifluorescence, ciblées pour l&#39;ensemble des cellules d&#39;enregistrement, rempli de neurobiotin, puis traitées pour l&#39;immunohistochimie.

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	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Cette technique est applicable à tous les enregistrements de cellules ganglionnaires rétiniennes à partir d&#39;une rétine isolée. Bien que, dans la lignée de souris utilisée ci-dessus intrinsèquement photosensibles, exprimant la mélanopsine CGR sont étiquetés avec EGFP 2, 5, ce protocole est facilement transférable à d&#39;autres lignes marquées par fluorescence CJR ou peuvent être généralisés à enregistrer à partir de CGR choisis au hasard ainsi. Cette technique est particulièrement pr?...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

Les premières étapes de la vision des vertébrés ont lieu lorsque la lumière stimule les photorécepteurs tige et le cône de la rétine 1. Cette information est ensuite séparé en ce qui sont connus comme les voies ON et OFF. Les informations sur le signal des photorécepteurs de lumière pour les cellules bipolaires (BCS), qui dépolariser en réponse à des augmentations (Sur CB) ou diminue (Off BC) de l&#39;intensité lumineuse. Cette ségrégation de l&#39;information lumineuse est maintenue au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui ont des dendrites stratifier soit dans le sublamina Off de la couche interne plexiforme (IPL), où ils reçoivent l&#39;entrée directe excitateurs de Off BCS, ou de la stratification dans les Sur l&#39;sublamina de l&#39;IPL, où ils reçoivent l&#39;entrée directe à partir excitateurs Le BCS. Cette ségrégation des informations concernant les augmentations ou diminutions d&#39;éclairement (On et Off voies) est conservée et signalés au cerveau en parallèle. Le CGR sont les cellules de sortie de la rétine, et sont donc une cellule important d&#39;étudier afin de comprendre comment l&#39;information est signalée à la lumière des noyaux visuelle dans le cerveau. Les progrès de la génétique de la souris sur les dernières décennies ont abouti à une variété de lignées de souris fluorescentes journaliste, où des populations spécifiques CJR sont étiquetés avec une protéine fluorescente pour permettre l&#39;identification des sous-types du CJR 2 3 4 et spécifiques de ciblage pour l&#39;enregistrement électrophysiologique. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;enregistrement des réponses de lumière à partir des cellules ganglionnaires marqués par fluorescence dans une intacte, la préparation rétine isolée. Cette préparation permet de rétine isolée à partir d&#39;enregistrements CGR où la tonnelle dendritiques est intact et les entrées dans la tonnelle dendritiques CJR ensemble sont préservés. Cette méthode est applicable à travers une variété de sous-types de cellules ganglionnaires et se prête à une grande variété d&#39;organismes unicellulaires techniques physiologiques.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d&#39;enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d&#39;une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d&#39;analyser sa morphologie.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vues.  University of Minnesota. Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neurosciences

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un modèle Optic Nerve Crush blessures murins pour étudier la rétine de survie des cellules ganglionnaires

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Isolement de la rétine de souris et traitement au méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires de la rétine

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Pleins feux sur l’auteur : Préparation à montage entier à base de méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires rétiniennes  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...