Soutenu par le Prix de développement de carrière de Research to Prevent Blindness, subventions des NIH EY19312 et EY19543 (VJK), ainsi que par subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness et EY02687 (Département d&#39;ophtalmologie et des sciences visuelles à l&#39;Université de Washington).

1. Fabrication d&#39;électrodes <ol><li> Préparer électrodes de verre. Peser 120 mg agar et mélangez dans 10 ml d&#39;eau distillée (concentration finale de 1,2% de gélose). Faire fondre la solution de gélose dans un bain d&#39;eau chaude. Remplir le verre capillaires (nous utilisons des instruments Presision mots TW100-4 capillaires avec les dimensions suivantes: longueur = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, et le volume interne = 44 pi) avec la solution de gélose à l&#39;aide seringue en plastique. Solidifier la gélose à la température ambiante pendant 10 min. Ainsi, jusqu&#39;à ~ 200 capillaires peuvent être remplis (le reste du mélange agar peut être conservé à -4 ° C et réutilisés plusieurs fois). </li><li> Couper les capillaires en deux moitiés à l&#39;aide d&#39;un couteau de diamant. </li><li> Faire tremper les électrodes de verre résultant dans une solution d&#39;électrode de la souris pendant au moins 24 heures à 4 ° C. Conserver les électrodes à 4 ° C et les utiliser au cours de la période de 3-4 mois. </li></ol> 2. Configuration du test <ol><li> Dark-adapter une souris toute la nuit. Utilisez de type sauvage (par exemple, C57Bl / 6) souris pour tige axées sur les enregistrements transretinal et T alpha - / - tige souris dépourvues de signalisation 8 pour les enregistrements cône transretinal. </li><li> Préparer une solution à 1 perfusion L, 100 ml solution d&#39;électrode, et 20 ml solution d&#39;incubation (voir ci-dessous) et de filtrer le creux solution de perfusion de 0,45 um ou Millipore 0,22 um filtre (en option). </li><li> Calibrer la source de lumière (505 nm LED ou stimulateur ampoule halogène optique) en utilisant un photomètre placé au niveau du plan de la rétine. Dans le cas de source de lumière LED, utilisez un diffuseur optique d&#39;assurer l&#39;uniformité de la lumière. </li><li> Préparer la chambre de perfusion pour l&#39;expérience (constructions de chambre peut varier). Cette enceinte est constituée de 3 mm plexiglas, avec un fond fabriqué à partir du couvercle de boîte de Pétri petite plastique, et a un volume actif de perfusion ~ 400 pi (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Remplir l&#39;espace d&#39;électrode inférieure de la chambre avec une solution d&#39;électrode contenant 2 mM de L-glutamate et 10 mM BaCl 2. Utilisation tube en plastique et un capillaire en verre, établir une connexion entre la solution dans l&#39;espace d&#39;électrode inférieure (fait de raccord de tubulure en plastique fixé à la partie inférieure de chambre) et le porte-électrode. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles dans l&#39;électrode, le tube de raccordement, ou le porte-électrode (purger la solution en utilisant une seringue en plastique si nécessaire). </li><li> Monter la chambre d&#39;enregistrement sur la platine du microscope (facultative: le microscope peut être monté sur une table de antivibratoire et blindé à l&#39;intérieur d&#39;une cage de Faraday pour minimiser le bruit mécanique et électromagnétique). Connecter le porte-électrode inférieure au pôle headstage positive de l&#39;amplificateur différentiel (par exemple Warner Instruments DP-311 amplificateur). Centrer et aligner l&#39;électrode chambre inférieure d&#39;ouverture avec la tache de lumière de relance. Connectez la ligne de perfusion à la chambre d&#39;enregistrement et de tourner la perfusion sur. </li><li> Bubble la solution de perfusion avec 95% de O 2/5% CO 2 tout en incubation à 40 ° C watsalle de bain er. CO 2 ajuste le pH de la solution à 7,2. La solution s&#39;écoule de la bouteille vers la chambre de l&#39;enregistrement par gravité en passant par une résistance en céramique le réchauffant à 36-37 ° C. Afin de réduire les pertes de chaleur, le chauffe-eau doit être situé aussi près de la chambre d&#39;enregistrement que possible, idéalement sur la scène du microscope. </li><li> Avec un régulateur de débit régler le débit d&#39;environ 1 ml / min. </li><li> Connecter l&#39;électrode supérieure à la seconde (négative) du pôle de headstage l&#39;aide d&#39;un second porte-électrodes. Lier la sonde à thermocouple à l&#39;électrode supérieure en utilisant une bague O-. Faire en sorte que les pointes d&#39;électrodes et le thermocouple sont rapprochés de sorte que la lecture de la température est prise au plus près du centre de la rétine que possible. Immerger la pointe de l&#39;électrode supérieure dans la solution de perfusion et le placer dans le centre de la chambre. Laisser 10-15 minutes pour la stabilisation de base. </li><li> Ajuster la tension de courant continu pour l&#39;élément chauffant de sorte que la température de la solution est de 36 -37 ° C. </li></ol> 3. Isoler la rétine de souris <ol><li> Sous une lumière rouge sombre, euthanasier la souris adapté à l&#39;obscurité avec le CO 2 et de la dislocation cervicale. Facultatif: faire une marque de référence sur chaque globe oculaire de la souris par cautériser le point le plus dorsale de la sclérotique avec un stylo cautérisation ou broches chauffée dissection. Toutes les procédures subséquentes sont effectuées sous la lumière infrarouge à l&#39;aide de convertisseurs d&#39;images infrarouges ajustement à un microscope à dissection. </li><li> Disséquer les yeux avec des ciseaux courbes en appliquant une pression douce et tendre la peau sur les côtés de chaque œil. Hemisect deux globes oculaires sous un éclairage infrarouge à l&#39;aide microciseaux ou une lame de rasoir. </li><li> Retirez la cornée et le cristallin. Retirez autant du corps vitré que possible. </li><li> Peler la rétine d&#39;abord de la couche de l&#39;épithélium pigmentaire et, si nécessaire, nettoyer en profondeur avec une pince pour enlever granulés restants de l&#39;épithélium pigmentaire. Nous sommes généralement en utilisant des rétines ensemble à la fois pour cônes et des bâtonnets transretenregistrements Inal. Toutefois, si vous souhaitez enregistrer à partir spécifiquement la partie dorsale de la rétine de la souris qui a plus M / L-cônes 9, avant de les peler la rétine enlever la partie ventrale de l&#39;œilleton d&#39;une lame de rasoir ou microciseaux utiliser la marque cautérisation comme une référence. </li><li> Placez le globe oculaire seconde hemisected dans une petite boîte de Petri avec une solution d&#39;incubation et incuber la préparation dans une boîte étanche à la lumière saturée en oxygène pur jusqu&#39;à son utilisation. Généralement, dans ces conditions l&#39;œilleton deuxième souris peuvent être stockés pendant plusieurs heures à température ambiante et utilisé pour les enregistrements. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un verre ou pipette en plastique de transférer la rétine isolée à une goutte de solution de perfusion (environ 300 pi) sur le couvercle d&#39;une boîte de Pétri. Ajouter 5-6 petites gouttes de solution d&#39;électrode contenant BaCl 2 à pré-incuber la rétine avec BaCl 2. Placez un carré (environ 5x5 mm) de la face arrière coin-graissé (nous utilisons Dow Corning lubrifiant pour valve 111 et mastic) Millipore filtre en papier (0,45 um HArg type) avec pré-faites le trou en son centre (2-2,5 mm de diamètre) à la chute de la même solution. Utilisation de la position des pinces de la rétine sur le dessus du papier filtre (côté photorécepteur vers le haut) et appuyez sur ses bords à la périphérie de plate-il monter. La rétine doit être centré sur l&#39;ouverture dans le papier filtre. </li><li> En utilisant des pinces de transférer le papier filtre avec la rétine à la chambre de perfusion et le placer au-dessus du stimulus place aligné espace électrode inférieure. Appuyez légèrement sur les bords graissés du papier filtre pour le lier avec la chambre. </li><li> Placez l&#39;électrode supérieure sur le centre rétine (légèrement toucher la couche des photorécepteurs). Centrage de l&#39;électrode supérieure sur la rétine augmente l&#39;amplitude du signal (% ~ jusqu&#39;à 20-40 par rapport à la plaçant plus près du bord rétine). Bien que l&#39;emplacement, cette électrode déforme légèrement l&#39;intensité de la lumière efficace de stimulation pour atteindre un petit secteur de la rétine (~ 12-15% de sa superficie totale), il est encore le meilleur moyen de placer l &#39;électiontrode. La préparation est maintenant prêt pour les enregistrements transretinal. </li></ol> 4. Enregistrements Transretinal <ol><li> En fonction de votre lignée de souris, record tige ou M / L-cône axées sur les réponses de flash d&#39;essai de faible à l&#39;intensité lumineuse de la lumière calibrée 505 nm à condition de la source lumineuse LED ou stimulateur optique. Dans le cas de notre source de lumière LED, l&#39;intensité du flash est contrôlée par une combinaison de contrôle informatisé de la tension d&#39;entrée LED, résistances commutables, et un ensemble de filtres de densité neutre (nous utilisons E-Colour # 211 0,9 filtres ND de films des Laboratoires Rosco ) placé entre la diode et la rétine. La durée de la LED éclair de test (20 ms) est commandé par un ordinateur. Si en utilisant un stimulateur ampoule halogène optique, l&#39;intensité du flash de test et de longueur d&#39;onde peut être commandé par un ensemble de filtres de densité neutre et étroites filtres d&#39;interférence de bande, respectivement. Test de durée d&#39;éclair peut être contrôlé par ordinateur axées sur les volets. </li><li> Facultatif: pour le maintien de l&#39;efficacitésuppression de la composante gliale de photoréponse avec BaCl 2 tout au long de la journée, de changer la solution électrode inférieure occasionnellement (par exemple, avant l&#39;essai de chaque rétine) en le purgeant à l&#39;aide d&#39;une seringue en plastique rempli avec une solution fraîche. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Solutions <ol><li> Solution pour perfusion souris rétine: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM d&#39;HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinate, 0,5 mM de Na glutamate, 0,02 mM EDTA, et 10 mM de glucose. En outre, la solution est complétée par 2 mM de L-glutamate et 10 uM DL-AP-4 pour bloquer les composants d&#39;ordre supérieur de la photoréponse 10,11, et avec 0,1% MEM MEM vitamines et acides aminés des solutions (Sigma) pour améliorer la rétine la viabilité. </li><li> Solution d&#39;électrode souris: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). La solution dans l&#39;élément inférieurespace ctrode contient également 2 mM de L-glutamate de bloquer la transmission synaptique 10 et, en outre, 10 mM de BaCl 2 pour supprimer la composante gliale de la photoréponse 3,12. </li><li> La solution d&#39;incubation Retina: dissoudre 272 mg L-15 (Sigma) et 20 mg de BSA dans 20 ml d&#39;eau déminéralisée. Finale L-15 et les concentrations de BSA sont 13,6 mg / ml et 1 mg / mL, respectivement. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl 1 M. </li></ol><img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma montrant l&#39;isolement de la rétine de la souris pour les enregistrements ERG transretinal. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> Figure 2. Photographie de la chambre de perfusion et des électrodes d&#39;enregistrement avec leurs détenteurs. Les flèches rouges indiquent la direction de débit de perfusion. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; Figure 3. Schéma du dispositif expérimental pour les enregistrements ERG transretinal. Les flèches rouges indiquent la direction de débit de perfusion. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> Les résultats représentatifs Figure 4:. Enregistré famille de souris tige axées sur les réponses transretinal. Photoresponses étaient filtré passe-bas à 30 Hz (8 pôles de Bessel), numérisé à 1 kHz et stockées sur un ordinateur pour une analyse plus approfondie. Traces affichées représentent les moyennes des réponses à des intensités 5-6 de faible luminosité et 2-3 réponses à des intensités lumineuses saturantes. <img alt="Figure 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> Figure 5: Les résultats représentatifs. Famille enregistré de souris cône axées sur les réponses transretinal. Photoresponses étaient filtré passe-bas à 30 Hz (8 pôles de Bessel), numérisé à 1 kHz et stockées sur un ordinateur pour une analyse plus approfondie. Traces affichées sont averages des réponses à des intensités 5-10 de faible luminosité et 3-5 réponses à des intensités lumineuses saturantes.

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	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

La méthode de la canne et de cône axées sur les enregistrements ERG transretinal décrit ci-dessus est de devenir un outil puissant pour étudier la fonction des photorécepteurs de la souris à la fois de type sauvage et les animaux génétiquement modifiés. En plus de la caractérisation facile des propriétés photoréponse de base, cette technique simple offre une stabilité excellente réponse au cours de longue durée des expériences effectuées sur les préparatifs rétine proche de l&#39;intactes. Les deux ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td> DL-PA-4 </td><td></td><td> Biosciences Tocris </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Tous les autres réactifs </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Verre capillaires </td><td></td><td> Instruments de précision du monde </td><td> TW100-4 </td><td> Pour la réalisation d&#39;électrodes </td></tr><tr><td> Le papier-filtre </td><td> HArg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Photomètre </td><td></td><td> Instruments UDT </td><td> S350 </td><td> Pour l&#39;étalonnage de lumière </td></tr><tr><td> Capteur en silicium radiométrique </td><td></td&gt; <td> Instruments UDT </td><td> 221 </td><td> Pour l&#39;étalonnage de lumière </td></tr><tr><td> Table anti-vibration </td><td></td><td> Technique Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Pour minimiser les bruits mécaniques </td></tr><tr><td> Compresseur d&#39;air Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther international </td><td> P 15TC </td><td> Connecté à table anti-vibration </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Pour la dissection oeil de la souris </td></tr><tr><td> Convertisseurs d&#39;images infrarouges </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Lié à stéréomicroscope </td></tr><tr><td> Amplificateur différentiel DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel 8-pôles filtre </td><td></td><td> KROHN-HITE Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Résistance en céramique </td><td></td><td> TE connectivité </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Pour réchauffer la solution de perfusion </td></tr><tr><td> Thermocouple </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur de température </td><td></td><td> Oméga </td><td> DPi32 </td><td> Connecté à thermocouple </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Pour appliquer clignote d&#39;essais et de lumière de blanchiment </td></tr><tr><td> Cautère </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Pour marquer la partie dorsaledu globe oculaire souris </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 électrophysiologie Acquisition de données et le logiciel d&#39;analyse </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

Il ya deux classes distinctes de formation d&#39;image photorécepteurs de la rétine des vertébrés: les bâtonnets et les cônes. Les bâtonnets sont capables de détecter des photons uniques de lumière alors que les cônes fonctionnent en continu dans l&#39;évolution rapide des conditions de forte luminosité. Absorption de la lumière par la canne et de cône spécifiques pigments visuels dans les segments externes des photorécepteurs déclenche une cascade de phototransduction qui mène éventuellement à la fermeture de nucléotides cycliques-dépendants canaux sur la membrane plasmique et une hyperpolarisation cellulaire. Ce changement induit par la lumière dans la membrane actuelle et potentielle peut être enregistré comme une photoréponse, soit par aspiration 1,2 électrode technique classique d&#39;enregistrement ou par des enregistrements électrorétinogramme transretinal (ERG) de rétines isolées avec pharmacologiquement bloqués éléments de réponse post-synaptiques 3-5. Cette dernière méthode permet de drogues accessibles durables enregistrements à partir de photorécepteurs de la souris et est particulièrement utile pour l&#39;obtention photoresponses stables from les cônes de souris maigres et fragiles. Dans le cas de cônes, de telles expériences peuvent être effectuées à la fois dans des conditions adaptés à l&#39;obscurité et qui suit un éclairage intense qui blanchit la quasi-totalité pigment visuel, pour surveiller le processus de récupération de photosensibilité cône pendant adaptation à l&#39;obscurité 6,7. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment effectuer tige et M / L-cône axées sur les enregistrements de transretinal adaptés à l&#39;obscurité rétine de souris. Rod enregistrements seront effectués en utilisant des rétines de type sauvage (C57BL / 6) chez la souris. Par souci de simplicité, les enregistrements de cône sera obtenu à partir d&#39;OGM tige transducine α-sous-unité KO (Tα - / -) des souris qui n&#39;ont pas de tige de signalisation 8.

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Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l&#39;obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.

Transretinal Recordings ERG de rétine de souris: Rod et Photoresponses Cône

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.6K vues.  Washington University School of Medicine. Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l'obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.

Vidéo: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome sectionnement rétine de souris pour préparer des cultures photoréceptrices

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

Lorsque vous coupez des questions : Une Dissection et Guide de l’analyse de l’Orientation spatiale de la rétine de souris de repères oculaires

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

Enregistrements EEG non invasive de bouger librement des porcelets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualisation de la croissance axonale cône effondrement et effets précoces de β-amyloïde dans des neurones cultivés de souris

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Cultures enrichies en cônes de la rétine d’embryons de poulet pour étudier les interactions cellulaires entre tiges et cônes

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Lecture des lésions vasculaires dans la rétine de souris pour favoriser la reproductibilité

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.