Les auteurs remercient le Dr James Bamburg et des membres de son laboratoire pour la collaboration dans ces études. Ce travail a été financé par des subventions du NIH HD19950, EY07133 et par des subventions de la Fondation Minnesota Medical.

Pour la rhodamine-actine étiquetage, les neurones sont cultivées sur des lamelles en verre placé dans le fond de 35 mm plats en plastique, ou sur des lamelles collées dans &quot;vidéo&quot; plats. 1. Préparation des Lamelles ou &quot;Video&quot; Plats <ol><li> Beaucoup de types de neurones sont mal adhésif pour substrats in vitro. Lamelles de verre, qui sont requis pour cette procédure, ne permettent pas suffisamment de neurones substrat d&#39;adhésion sauf si elles sont convenablement nettoyés et préparés. Une procédure détaillée pour l&#39;acide lavage et de nettoyage des lamelles en verre est décrite dans les cellules nerveuses de l&#39;ouvrage Culture, édité par Banker et Goslin. Alternativement, un revêtement nitrocellulose pour lamelles, qui lie avidement molécules de substrat, est décrit dans les étapes 1.7 et 1.8 ci-dessous. </li><li> Verre lamelles (par exemple des carrés de 18 mm ou 24 mm cercles) sont rincées dans de dH 2 O et cuit dans la chaleur sèche (≥ 225 ° C) aussi longtemps que possible (un minimum de plusieurs jours jusqu&#39;à trois mois ou plus) pour enlever les traces de composés organiques composés. Passez à l&#39;étape 1.6 ou pour les plats de la vidéo procéder à 1.3. </li><li> Pour créer un substrat de verre mince clair pour vidéomicroscopie de haute résolution, des trous circulaires de diamètre approprié sont percés dans le fond de 35 ou 50 mm ou de Petri en plastique des boîtes de culture tissulaire en utilisant un perce-bouchon électrique (ou un instrument similaire). Le forage est effectué lentement avec une légère pression pour éviter la fissuration du plastique. Bords du trou foré sont raclées avec des ciseaux afin de créer une surface lisse sur les deux côtés. </li><li> Lamelles de verre sont nettoyées pour une utilisation culture de tissus, tels que décrits en 1.1 ou 1.2. Lamelles sont collées en place au fil des trous, en utilisant du ciment non toxique d&#39;aquarium en silicone (pour lamelles 18x18mm, un peu de diamètre 12mm est utilisé). Le ciment est durci pendant 24 heures. </li><li> (Les étapes suivantes sont effectuées en utilisant des conditions stériles) Les plats vidéo sont rincés trois fois avec stériles dH 2 O et sécher à l&#39;air. </li><li> Lamelles sont recouvertes de molécules de substrat pour la culture neuronale. Tout d&#39;abord, la surface est enduite d&#39;lamelle (250 uL d&#39;18x18 lamelle) une solution de 100 ug / ml de poly-D-lysine dans du PBS pendant heures 4-8 (ou une nuit) dans un incubateur humidifié 38 ° C. Lamelles sont ensuite rincés 3 fois avec stériles O DH 2 pour enlever Unbound poly-D-lysine et sécher à l&#39;air. Beaucoup de types de neurones sont cultivées sur des lamelles recouvertes de poly-D-lysine seule, si les protéines sériques sont inclus dans le milieu de culture. Cependant, des résultats plus pertinents pour les conditions in vivo sont obtenues en utilisant des molécules du substrat naturel. Les solutions de ces molécules, telles que la laminine, fibronectine ou L1 CAM (1-20 mg / ml dans le PBS), peuvent être directement appliquées à la poly-D-lysine lamelles enduits pour 4-8 heures ou toute la nuit, mais dans notre laboratoire nous avons l&#39;habitude enrober les lamelles préparées avec un mince film de nitrocellulose avant d&#39;appliquer les molécules d&#39;adhésion cellulaire pour augmenter la protéine de liaison du substrat. </li><li> Faire une solution de nitrocellulose 1% en dissolvant 5 g de nitrocellulose dans 5 ml d&#39;acétate d&#39;amyle 100%. Appliquer 10 uL de cette solution à la lamelle et doucement l&#39;étaler sur la surface. Sécher à l&#39;air 10 minutes. </li><li> Appliquer 250 ul d&#39;une solution de 25 pg / ml de laminine ou 4 mg / ml L1 CAM dans le PBS et répartis sur la surface de nitrocellulose. Incuber 4 heures (ou une nuit) dans un incubateur humidifié 38 ° C, substrat aspirer et d&#39;ajouter immédiatement un milieu de culture, de sorte que le substrat ne sèche pas. </li></ol> 2. Préparation des cultures de neurones <ol><li> Embryonnaires embryons de Poulet de 7 jours sont supprimés à partir d&#39;oeufs, et placés dans des boîtes de Pétri 100 mm contenant du milieu de culture avec 10% de sérum pour la dissection d&#39;enlever les organes internes du thorax et l&#39;abdomen, à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. </li><li> Les embryons sont ensuite rincés à moyen et déplacé à une boîte de 60 mm avec un milieu liquide et d&#39;autres disséquées pour retirer et de préparer des explants de ganglions de la racine dorsale (DRG) ou neurones tissus rétiniens. Une description détaillée de dissection peut être trouvée dans Methods in Cell Biology, volume 71, Neurones: méthodes et applications pour le biologiste cellulaire, édité par Hollenbeck et Bamburg. Explants DRG sont ganglions 1/2-whole et neural explants rétiniens sont de 1 mm de diamètre ou moins. </li><li> Après le nettoyage des explants de tissus étrangers, des explants individuels sont déplacés avec des pinces horlogers à l&#39;lamelles, qui sont déjà dans des boîtes de culture avec le milieu de culture. Sous un microscope à dissection, l&#39;explant est doucement pressé pour le centre de la lamelle avec une pince pour empêcher tout mouvement pendant le transport à l&#39;incubateur. Les explants sont cultivés en milieu F12 avec B27 additifs, tamponné avec 10 mM d&#39;HEPES à pH 7,4 et placé une nuit dans un incubateur humidifié 38 ° C. Les facteurs de croissance peuvent être ajoutés, si nécessaire, au milieu de culture. Les neurotrophines sont souvent ajoutés à des cultures de DRG âgées embryons, même si les neurones DRG E7 s&#39;étendra axones d&#39;explants sans neurotrophines ajouté. Des explants de rétine neurale étendre axones dans ce milieu de culture sansdding facteurs de croissance. </li><li> Les cultures sont incubées pendant au moins 18 heures afin de permettre suffisamment excroissance axonale avant le début de la procédure ci-dessous. </li></ol> 3. Préparation du tampon de perméabilisation rhodamine-actine <ol><li> Une solution stock de tampon de perméabilisation contenant 138 mM, KCl 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2, et 1% de BSA (pH = 6,9) peuvent être conservés jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C11. Juste avant l&#39;utilisation, les composants suivants sont ajoutés pour une concentration finale de: 0,025% saponine, 0,1 mM d&#39;ATP, et 100 nM Alexa Fluor-350 phalloïdine. </li><li> Une solution séparée est également fraîchement préparés juste avant utilisation avec ces mêmes composants, plus 0.45μM rhodamine non musculaires d&#39;actine La solution est alternativement agité et tritrated pendant 5 min à dissoudre la rhodamine-actine touffes, et est vortexé pendant 1 min durant l&#39;étape initiale de perméabilisation pour empêcher la polymérisation dans le tube. Si malgré cela, l&#39;assemblage de filaments dans le tube reste un problème, la solution peut être centrifugé avant d&#39;utiliser. </li></ol> 4. Perméabilisation des cultures de neurones et incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine Ends barbelé <ol><li> Une boîte de culture avec des explants DRG ou rétinienne est soigneusement enlevé de l&#39;incubateur et les étapes suivantes sont réalisées à température ambiante. </li><li> Tous les changements de solutions doit être fait soigneusement. La pointe de la pipette devrait être placé au bord de la lamelle, et les solutions doivent être retirés et ajoutés lentement et avec une force minimale. </li><li> Le milieu de culture est retiré à la pipette avec soin, mais de façon constante, et le tampon de perméabilisation suffisant pour couvrir les cellules est ajouté pendant 1 min (pour x 18mm lamelle 18mm, ~ 60 pi). La culture n&#39;est pas rincée avec d&#39;autres solutions avant d&#39;ajouter le tampon de perméabilisation, et la lamelle n&#39;est pas autorisé à sécher avant d&#39;ajouter le tampon de perméabilisation. </li><li> Le tampon de perméabilisation est doucement retiré à la pipette et remplacé par le tampon de perméabilisation contenant 0,45 uM rhodamine non musculaires d&#39;actine pendant 4 min. </li><li> La rhodamine-actine contenant tampon est délicatement retiré à la pipette, et les neurones sont fixées par l&#39;ajout d&#39;une solution de paraformaldéhyde à 4% (qualité laboratoire, faite avec un tampon phosphate, pH 7,3), le glutaraldéhyde à 0,05% et 10% de saccharose. Après fixation 5 minutes les lamelles sont délicatement rincés avec du PBS, et monté dans Slowfade sur lames de verre de 3 pouces. </li><li> Une approche alternative aux solutions de change est d&#39;utiliser une cellule d&#39;écoulement. Ce peut être une cellule d&#39;écoulement commercialement disponible, ou une cellule d&#39;écoulement simple peut être fait en plaçant des petits morceaux de plastique (≤ 1 mm d&#39;épaisseur) que des entretoises dans les coins de la lamelle, puis monter une lamelle de taille égale au sommet de la lamelle. Des solutions peuvent être échangés en plaçant la pipette sur un côté de la cellule de débit et de retrait des solutions avec une mèche (coton ou une Kimwipe) de l&#39;autre côté. </li><li> L&#39;incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine fluorescente et de barbelés se termine-phalloïdine étiquetage des F-actine dans les cônes de croissance est visualisée avec épifluorescence optiques à travers un objectif à immersion 60X, et les images sont recueillies, en utilisant une caméra CCD refroidie. Un microscope confocal peut fournir l&#39;imagerie améliorée. </li><li> Pour une meilleure quantification de la rhodamine-actine incorporation toutes les images doivent être recueillies en une seule séance, en utilisant le même gain et les paramètres de l&#39;exposition de la sensibilité de la caméra numérique pour chaque image. L&#39;analyse de l&#39;étiquetage doit être fait à partir des régions équivalentes de chaque image; Metamorph, Image J ou similaire outils informatiques pour l&#39;analyse de l&#39;image peut être utilisée. </li></ol> VARIATIONS DE CETTE PROCÉDURE 5. Variation I: recueillir des images Live Cell Avant la rhodamine-actine Étiquetage <ol><li> Vidéo plats sont placés sur une platine de microscope réchauffé, et des images en direct du cône de croissance sont collectées. Maillées lamelles peuvent être utilisées, ou de gravures et / ou des marques stylo sur la lamelle peut être fait pour trouver plus facilement des cellules spécifiques après marquage, ou le plat vidéo peuvent être fixés en place sur la platine du microscope pour la durée de la procédure. </li><li> Perméabilisation, l&#39;incorporation de la rhodamine-actine, et la fixation de cellules sont réalisées dans le plat vidéo, soit sur ou hors de la platine du microscope. Après fixation, PBS est ajouté à des plats vidéo pour l&#39;imagerie immédiate. Afin de préserver l&#39;échantillon pour l&#39;imagerie tard, moyen slowfade montage est ajouté à la lamelle et une lamelle de taille égale est doucement placée sur le dessus (en évitant les bulles), et les bords sont ensuite scellés avec du vernis à ongles transparent. </li></ol> 6. Variation Deux: immunochimie à Co-label protéines supplémentaires <ol><li> Rhodamine-actine constitution et la fixation peut être réalisée sur des neurones cultivés sur des lamelles ou en plats vidéo, tel que décrit ci-dessus (04/02 au 04/04). </li><li> Après fixation, et de rinçage dans du PBS, les cellules sont traitées 15 min avec 0,1 M de glycine dans du PBS et ensuite extrait avec 0,1% de Triton X-100 (TX-100) dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 1 h. Lamellessont incubées avec l&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 1% de BSA pendant 1 h. Les lamelles sont ensuite rincés et incubées dans 0,1% TX-100 dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 1 h, avant d&#39;appliquer des anticorps secondaires fluorescents à dilution de 1:1000 dans du PBS avec 1% de BSA pendant 1 h. Après rinçage, les lamelles sont à nouveau incubées dans 0,1% TX-100 dans du PBS avec du sérum de chèvre 2% et 1% de BSA pendant 30 min, rincées et montées en anti-fading moyenne. La localisation de certaines protéines est perturbée par l&#39;étape de perméabilisation initiales (4,3). Pour conserver ces protéines pour la localisation avec des anticorps, le paraformaldéhyde 0,05% et 0,05% de glutaraldéhyde peuvent être ajoutés à la mémoire tampon de perméabilisation pendant 1 min (c&#39;est à dire avant d&#39;ajouter la rhodamine-actine) sans affecter l&#39;étiquetage fin barbelés par la rhodamine-actine. </li><li> Les images de cônes de croissance triple-étiquetés sont collectés par microscopie à fluorescence ou confocal. </li></ol> 7. Variation Trois: Évaluation des effets des signaux de guidage sur la F-actine extrémités libres barbelé <ol><li> Un facteur de croissance ou de signaux de guidage est ajouté à des boîtes de culture dans l&#39;incubateur à des concentrations de plusieurs ng / mL pendant quelques minutes (ou un temps de traitement approprié) avant de retirer le plat de l&#39;incubateur et le début de la procédure de perméabilisation. Cela permet l&#39;évaluation des effets à court terme de facteurs de croissance ou de signaux de guidage sur la F-actine extrémités libres de fer barbelé. </li><li> Un plat vidéo avec des cultures neuronales peuvent être placés sur une platine de microscope réchauffé, et des facteurs de croissance ou de signaux de guidage peut être libéré d&#39;une micropipette dans un gradient de près d&#39;un cône de croissance avant le début de la perméabilisation et la rhodamine-actine constitution. Par exemple, le NGF peut être libéré pour DRG neurones ou la nétrine pour neurale des cellules ganglionnaires de la rétine. La pipette peut être introduite pour aussi courte que 1-2 minutes avant le début de la procédure de perméabilisation. Cela permet l&#39;évaluation des effets locaux d&#39;un gradient de signal de guidage sur la formation de F-actine extrémités libres de fer barbelé dans les marges du cône de croissance leader (voir 10 citations de référence pour les images). </li><li> Ces variations peuvent être combinés avec des anticorps médiée étiquetage des autres composants neuronaux, comme décrit en 6.2 ci-dessus. </li></ol> 8. Variation IV: F-actine Étiquetage extrémité libre barbelé sur les neurones transfectées <ol><li> L&#39;utilisation de constructions constitutivement actif ou dominant-négatifs ou knockdown protéines à l&#39;aide d&#39;ARNi (avec un marqueur fluorescent identifiant) peut être utilisé pour évaluer l&#39;implication d&#39;une protéine dans la régulation de la F-actine extrémités libres de fer barbelé. Fonction de la protéine, sa localisation dans le cône de croissance, et si elle est fusionnée à un marqueur fluorescent, la protéine fluorescente exprimée dans les cellules transfectées peuvent être perdues lors de perméabilisation. Si c&#39;est le cas, de la vaisselle vidéo peut être utilisé pour identifier une cellule transfectée microscope avant de perméabilisation et la perméabilisation peut être effectuée sur la platine du microscope, après avoir marqué les positions des cellules transfectées. Alternativement, une construction GFP-actine peuvent être co-transfectées avec un GFP-construction d&#39;intérêt. Dans ce cas, la GFP-actine seront incorporés dans la F-actine, et ne sera pas perdue par perméabilisation, permettant l&#39;identification de cellules transfectées après perméabilisation. </li><li> Cette variation peut être combiné avec l&#39;ajout de signaux de guidage, comme décrit dans 7.1 à 7.3 ci-dessus. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Outre mondiale du NGF augmente totale de F-actine et la F-actine se termine barbelés à la marge du cône de croissance de premier plan. Quand un cône de croissance est stimulée DRG avec un facteur de croissance nerveuse (NGF) pendant 5 minutes, polymérisation de l&#39;actine est stimulée à la marge de premier plan, et une bande brillante de la rhodamine-actine étiquetage est perçu sur le pourtour du cône de croissance. La figure 1 compare la rhodamine-actine incorporation dans un cône de croissance DRG non stimulées et un cône NGF stimule la croissance DRG. La fluorescence verte dans les images fusionnées est étiquetage phalloïdine pour F-actine dans le cône de croissance et le rouge est la rhodamine-actine étiquetage. Un bon contrôle de l&#39;étiquetage final de fer barbelé est d&#39;ajouter de 10-6 M ou plus cytochalasine B ou D dans la mémoire tampon de perméabilisation dans les étapes 4.2 et 4.3. Cytochalasines bouchon F-actine se termine barbelés et inhibent la rhodamine-actine se liant à bouts de fer barbelé. Cela devrait considérablement réduire ou éliminer l&#39;incorporation de la rhodamine-actine dans la cellule. Barres d&#39;échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un gradient de NGF augmente localement F-actine se termine barbelé. Une micropipette qui libère le NGF est amené à un côté d&#39;un cône de croissance DRG pendant 2 minutes, suivie par l&#39;étiquetage de la F-actine extrémités libres de fer barbelé. Les images ci-dessous montrent que l&#39;exposition à un gradient de NGF stimule localement une augmentation de la F-actine extrémités libres barbelés dans la région du cône de croissance plus proche de la pipette. L&#39;image fusionnée montre phalloïdine en vertet la rhodamine-actine en rouge. La barre d&#39;échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Protéines ERM Activé s&#39;accumulent à la marge du cône de croissance de premier plan. Marquage immunocytochimique de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) avec F-actine extrémités libres de fer barbelé. Glutaraldéhyde (0,05%) et paraformaldéhyde (0,05%) ont été ajoutés à la mémoire tampon de perméabilisation initiaux pendant une minute afin de préserver la localisation du MCE. Rhodamine-actine, rouge; PERM, vert; phalloïdine, bleu. La barre d&#39;échelle, 10 um. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Stimulation de la polymérisation de l&#39;actine nécessite protéines ERM actif. DRG dissociées ont été co-transfectées avec GFP-actine et un contrôle GFP plasmide ou un dominant négatif Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) construire. L&#39;utilisation de la GFP-actine permet l&#39;identification de cellules transfectées après perméabilisation. Ici, le NGF a été ajouté 5 min avant l&#39;étiquetage de F-actine se termine barbelé. Notez le cône de croissance transfectées avec DN MCE a réduit les niveaux de la fin barbelés à la marge du cône de croissance menant (panneau inférieur du milieu), qui contraste avec un cône de croissance non transfectées proximité (panneaux inférieurs), ou avec le contrôle GFP (panneau du milieu en haut). Rhodamine-actine, rouge; GFP-actine, vert. Barres d&#39;échelle, 10 um.

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Les méthodes présentées ici permettent la résolution temporelle et spatiale des composants cellulaires qui sont impliquées dans le remodelage dynamique du cytosquelette d&#39;actine à la marge de premier plan de migration des cônes de croissance. L&#39;action des molécules attractives, comme le NGF ou nétrine, de stimuler rapidement filaments d&#39;actine de polymérisation se révèle comme une augmentation locale de l&#39;actine se termine barbelés, créé par filaments d&#39;actine séparation par activées...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Les conseils mobiles des axones en croissance sont appelées cônes de croissance. Cônes de croissance conduisent naviguer axones à travers les tissus en développement en interaction avec les signaux de guidage exprimés au niveau local moléculaires qui lient les récepteurs du cône de croissance et de réguler la dynamique et l&#39;organisation du cytosquelette de la croissance cône 3-6. La cible principale de ces signaux de navigation est le maillage filament d&#39;actine qui remplit la périphérie du cône de croissance et que la motilité du cône de croissance grâce à des lecteurs polymérisation de l&#39;actine et le remodelage continu dynamiques 7. Signaux de guidage positif ou attrayante induisent cône de croissance tourne en stimulant filaments d&#39;actine (actine F) de polymérisation dans la région de la périphérie du cône de croissance qui est près de la source de la queue attractif. Cette polymérisation de l&#39;actine disques locaux cône de protrusion de croissance, l&#39;adhérence de la marge de leader et l&#39;allongement des axones vers l&#39;attractif. Filaments d&#39;actine de polymérisation dépend de la disponibilité du monomère d&#39;actine suffisante et sur les noyaux de polymérisation ou se termine filament d&#39;actine barbelés pour l&#39;addition de monomère. L&#39;actine monomère est disponible en abondance dans le ganglion de la racine dorsale de la rétine et poussins (GHM) des cônes de croissance. En conséquence, la polymérisation augmente rapidement quand il est libre F-actine se termine barbelés deviennent disponibles pour l&#39;addition de monomère. Cela se produit dans chiches DRG et les cônes de croissance rétiniens via l&#39;activation locale de l&#39;actine F-actine rupture protéines dépolymérisation facteur (ADF / cofiline) dans la région du cône de croissance plus proche d&#39;un 80-10 attractif. Ce accrue ADF / cofiline activité Severs filaments d&#39;actine à créer de nouveaux F-actine se termine barbelés pour la polymérisation. La méthode suivante illustre ce mécanisme. Contenu total de la F-actine est visualisée par coloration avec la phalloïdine fluorescente. F-actine se termine barbelés sont visualisés par l&#39;incorporation de la rhodamine-actine dans les cônes de croissance qui sont perméabilisées avec la procédure décrite dans la suivante, qui est adapté à partir des études antérieures sur d&#39;autres cellules mobiles 11, 12. Lorsque la rhodamine-actine est ajouté à une concentration supérieure à la concentration critique pour l&#39;addition de monomères d&#39;actine à l&#39;extrémité de fer barbelé, la rhodamine-actine assemble sur des extrémités libres de fer barbelé. Si le repère attractif est présenté dans un dégradé, comme d&#39;être libéré d&#39;une micropipette positionné sur un côté d&#39;un cône de croissance, l&#39;incorporation de la rhodamine-actine sur F-actine se termine barbelés sera plus grande dans le côté du cône de croissance vers la micropipette 10 . Cônes de croissance sont des structures à petites cellules et délicat. Les procédures de perméabilisation, la rhodamine-actine incorporation, la fixation et la visualisation de fluorescence sont tous soigneusement fait et peut être menée sur la scène d&#39;un microscope inversé. Ces méthodes peuvent être appliquées à l&#39;étude de polymérisation de l&#39;actine locale dans les neurones en migration, d&#39;autres cellules des tissus primaires ou de lignées cellulaires.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l&#39;actine se termine sans barbelés.

Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vues.  University of Minnesota. Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l'actine se termine sans barbelés.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Recherche

Neurosciences

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Enregistrement à grande échelle ensembles neuronaux avec des sondes en silicone chez le rat anesthésié

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...