This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1 Préparation de la poly-D-lysine de bromhydrate <ol><li> Préparer 1 mg / ml de bromhydrate de poly-D-lysine dans 0,1 M de tampon borate (pH 8,5). </li><li> Aliquote et conserver à -20 ° C. </li></ol> Revêtement 2 Poly-lysine de Lamelles Remarque: effectuer toutes les étapes de nettoyage et de revêtement dans une chambre à flux laminaire. <ol><li> La place des lamelles dans une boîte de Pétri contenant acide chlorhydrique 1 N (HCl) pendant 2 heures. </li><li> Aspirer HCl et rincer à l&#39;éthanol à 70% (EtOH) 2-3x. </li><li> Laisser EtOH à 70% pendant 1 heure. </li><li> Aspirer EtOH à 70% et rincer à 100% EtOH 2-3x. </li><li> Laisser EtOH à 100% pendant 2 heures. Aspirer tout EtOH. </li><li> Sécher avec du papier filtre et l&#39;air sec pendant quelques secondes. </li><li> Lieu O N en 1 mg ml de solution / / poly-lysine. </li><li> Rincer lamelles de lendemain avec Millipore 4-5x de l&#39;eau. </li><li> Air poly-lysine sec revêtu lamelles sur des rouleaux de verre dans une boîte de Petri propre. </li><li> Pour immunohistochemistry, utiliser 35 x 10 mm boîte de Petri couvercles. Préparer Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) bordée plats en versant PDMS (élastomère et de l&#39;agent de durcissement 10: 1 en poids) dans le plat à une épaisseur de 0,3 cm et laisser reposer à 30 ° CO / N. Une fois que cela a pris, coupez les en 2 cm par 1 cm incrustés dans les PDMS. Nettoyer et enduire le médaillon de poly-lysine suivant les mêmes étapes comme mentionné ci-dessus pour lamelles. </li><li> Magasin lamelles et des plats revêtus de poly-lysine couverts à l&#39;intérieur de la chambre à flux laminaire jusqu&#39;à utilisation (jusqu&#39;à 2 semaines, mais d&#39;atteindre de meilleurs résultats adhésives en préparant régulièrement tous les 3-4 jours). </li><li> Préparer un bloc de PDMS, de la broche de la moelle épinière dans le trancheur de tissu vibrant. Mélange élastomère et un élastomère B de 1: 1 en poids. Verser dans un plat de 100 x 15 mm Petri et laisser reposer O / N à 30 ° C. Coupez un morceau rectangulaire des PMDS et il colle à la plaque de base de tranchage en utilisant de la colle époxy. Laisser sécher la colle fixant les PDMS en place et couper plusieurs sections minces à la surface pour obtenir un platsurface à la broche sur le tissu. </li></ol> 3. aiguë dissociation de la lamproie de la moelle épinière à un rendement isolé axones réticulo <ol><li> Anesthésier un ammoecoete ou adulte lamproie (Petromyzon marinus) avec tricaïne méthanesulfonate (MS-222; 100 mg / L). Ajouter anesthésique dans l&#39;eau, dans un gobelet en plastique recouvert par un couvercle, contenant la lamproie à être sacrifié. </li><li> Décapiter lamproie dans le froid (4 ° C) de la solution de Ringer de la composition suivante (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, l&#39;osmolarité de 270 mOsm) et retirer le corps muscles de la paroi afin d&#39;exposer la surface dorsale de la moelle épinière. </li><li> Retirer méninges primitiva de la face dorsale de la moelle épinière à l&#39;aide de pinces fines. Ne retirez pas ventrale méninges primitiva à ce stade. </li><li> Couper la moelle épinière dans 1 cm de long morceaux. </li><li> Epingler un morceau de la moelle épinière à l&#39;aide de fines broches insectes, face dorsale vers le haut, sur un PDMS bordée trancher pla de basete (voir 2.12) dans une chambre de trancheuse de tissu vibrant contenant la solution de Ringer glacée. </li><li> Retirer une partie centrale de la colonne dorsale de la moelle épinière par découpage le long de l&#39;axe rostro-caudal de la lame, laissant les sections intactes de la colonne dorsale de la rostrale et caudale extrémités pour servir de poignées pendant le processus de dissociation figure 2a et la figure 2b. Utilisez le plus lent réglage de la vitesse qui permet le découpage et un réglage de la profondeur qui élimine seulement la colonne dorsale de quitter le sous-jacent colonne axone réticulo Figure 2b en bon état. </li><li> Incuber tranches pièces de la moelle épinière à la température ambiante pendant 45 min dans un cocktail de 1 mg / protéase ml (type XIV de Streptomyces griseus) et 1 mg / ml de collagénase préparé (type IA de Clostridium histolyticum) dans la solution de Ringer (adapté de El Manira &amp; Bussières 1997 17). </li><li> Pièces de la moelle épinière Pin enzyme traitée à l&#39;aide de broches fines dans un PDMS alignés boîte de Petri containing froid (4 ° C) la solution de Ringer. </li><li> Retirer ventrale méninges primitiva avec des pinces fines. </li><li> Couper les secteurs latéraux de la moelle épinière avec une lame de scalpel au milieu de la partie dorsale en tranches quittant la colonne centrale des axones intacts réticulo dans la moelle épinière figure 2d. </li><li> Déposer une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur la lentille. </li><li> Placer la lamelle de poly-lysine recouvert (figure 3a, la pièce supérieure, rectangle rouge) dans la fente de la chambre d&#39;enregistrement Figure 3 et appliquer de la graisse à vide à tous les bords (espace entre les rectangles rouge et bleu sur la figure 3a, pour faciliter un joint d&#39;étanchéité. Vis le haut en place. Placer la chambre dans l&#39;encart sur la plate-forme d&#39;enregistrement. </li><li> Ajouter la solution de Ringer dans la chambre d&#39;enregistrement en utilisant une pipette Pasteur. </li><li> Raccorder le tuyau d&#39;écoulement de sortie de la bouteille sous pression contenant une solution antigel à la tubulure d&#39;entrée du dispositif de refroidissement thermoélectrique. Connectez le output tube du dispositif de refroidissement thermoélectrique à l&#39;extrémité d&#39;entrée de la chemise de refroidissement externe et l&#39;extrémité de sortie du réservoir de la figure 3b. </li><li> Placer un morceau de la moelle épinière à la fois dans la chambre d&#39;enregistrement et séparer en douceur le maintien de la moelle épinière le long de la lamelle couvre-objet à tout moment à l&#39;aide de pinces recouvertes de téflon sont isolés jusqu&#39;à ce que les axones figure 2e et 2f figure. </li><li> Amener la température de la solution d&#39;enregistrement à 10 ° C par passage de la pression (de l&#39;azote gazeux est repoussé dans le flacon) solution antigel (par déplacement), par l&#39;intermédiaire du dispositif de refroidissement thermoélectrique, à travers la chemise de refroidissement externe de la chambre d&#39;enregistrement figure 3b. </li><li> Autoriser les axones de récupérer pendant 1 heure après la dissociation à 10 ° C. </li></ol><img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figure 2: Représentation schématique de protocole de dissociation pour l&#39;isolation des axones réticulospinaux. (A) Retrait de la colonne dorsale. La flèche indique la direction de découpe du tissu. Les cornes dorsales sont marquées par l&#39;alphabet D (couleur de police rouge), tandis que les cornes ventrales de l&#39;alphabet V (couleur de police rouge). (B) la colonne dorsale enlevé dans la partie centrale de la moelle épinière exposer les axones réticulospinaux (lignes vertes ). Les cornes ventrales, qui restent intactes après le processus de découpage, sont marqués par l&#39;alphabet V (couleur de police rouge). (C) de traitement de 45 min avec la protéase et de la collagénase enzymes de cocktail (1 mg / ml). (D) Le découpage des voies latérales de la moelle épinière; indiquant la position, la direction et l&#39;ampleur de coupe latérale. (e) de dissociation mécanique de la moelle épinière. Les flèches indiquent la position de la pince et la direction de la force de séparation lors de la dissociation. (F) Representatiexemple de préparation de l&#39;axone réticulo dissocié ve. Les flèches vertes marquent régions d&#39;axones réticulospinaux très dissociés sans processus post-synaptiques. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 Schéma de la chambre pour des expériences d&#39;électrophysiologie de l&#39;enregistrement. Dimensions fournies sont en pouces. Rectangle rouge montre la basepiece schéma (a) indique le positionnement de la lamelle dans la rainure de la lamelle dans la basepiece. La région entre le rectangle rouge et bleu, représenté sur le schéma de basepiece (a) est l&#39;endroit où la graisse à vide élevé est appliqué. (B) représente la chambre d&#39;enregistrement assemblée. 4. étiquetage et d&#39;identification des terminaux présynaptiques avec FM 1-43 <ol><li> Étiqueter terminaisons présynaptiques, en incorporant FM 1-43 en vesicles pendant synaptique exo-endocytose en haute dépolarisation K +. Perfuser préparation avec 5 uM FM 1-43 (dans 5 ml de solution de Ringer contenant mM KCl 30). </li><li> Perfuser préparation avec 1 mg / ml Advasep-7 (dans 5 ml de solution de Ringer) pour éliminer le colorant FM excès) 18. </li><li> Perfuser préparation avec la solution de Ringer pendant 15 min au lavage de colorant Remant et la Advasep. </li><li> Image avec 100 X lentille à immersion d&#39;huile (NA 1,25) sur un microscope inversé à fluorescence, en conjonction avec une caméra CCD numérique et l&#39;acquisition d&#39;images microgestionnaire de logiciel, en utilisant des protocoles d&#39;imagerie de fluorescence standard. </li><li> Identifier les terminaisons présynaptiques marquées par fluorescence à cibler pour l&#39;enregistrement de la figure 4c et figure 4d. </li></ol> 5. immunohistochimie de isolés axones réticulo <ol><li> Remplissez plat encadré (section Protocole 2.10.) Avec bivalent-ion (Ca2 + et Mg 2 +) libreLa solution de Ringer. </li><li> Fabriquer pipettes de patch dans une micropipette extracteur P-87. Placer une petite quantité de suture de la colle à une extrémité de l&#39;insert de poly-lysine à l&#39;aide d&#39;une pipette de patch (1,5 mm de verre de diamètre externe) et d&#39;aspiration (en utilisant un tube de silicone 0,89 mm de diamètre intérieur avec une pointe de la micropipette fixé à l&#39;extrémité d&#39;aspiration). </li><li> Effectuer dissociations en utilisant la même procédure que mentionné dans la section du protocole 3 de la figure 2. Placez une extrémité de la moelle épinière sur la colle de suture et appuyez doucement avec une pince pour la faire adhérer fortement à la surface. Placer une goutte de colle suture à l&#39;autre extrémité de l&#39;insert et étirer doucement jusqu&#39;à ce que la moelle épinière et les axones sont dissociés adhérer l&#39;extrémité libre de la moelle épinière en le faisant glisser doucement sur la colle de suture. Fixer en place par un pressurage doux vers le bas avec la pince. </li><li> Bourse bivalent libérer la solution de Ringer avec la solution de Ringer régulière par perfusion. </li><li> Autoriser les axones de récupérer pendant 20 min après dissociation à 10 ° C. </li><li> Fixer les axones dissociés dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) {préparé dans le tampon phosphate salin (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} pendant 20 min. Filtre PFA solution avant l&#39;utilisation par passage à travers un filtre seringue de 0,2 uM. </li><li> Laver le PFA en perfusant 0,1 M de glycine (dans du PBS) pendant 10 min. </li><li> Incuber à 0,1% de Triton-X (dans du PBS) pendant 10 min. </li><li> Laver en perfusant du PBS pendant 20 min. </li><li> Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 6 heures à 4 ° C. </li><li> Ajouter à anticorps primaire à CCAGV d&#39;intérêt (dilution 1: 200 dans du PBS) et incuber pendant 20 heures à 4 ° C. </li><li> Laver en perfusant du PBS pendant 20 min. </li><li> Bloc avec 5% de lait écrémé (dans du PBS) pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter à un anticorps secondaire (1: 400 de dilution en PBS) et incuber dans l&#39;obscurité pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min. </li><li> Bloquer avec 1% de sérum bovin Albumin (dans du PBS) pendant 20 min. </li><li> Ajouter à Alexa Fluor 488 phalloïdine (5 unités / ul concentration de travail; mère préparée dans du méthanol 200 unités / ml). </li><li> Laver par perfusion avec du PBS pendant 20 min. </li><li> Image à l&#39;aide 100X eau lentille à immersion sur microscope confocal. </li></ol> 6. électrophysiologique d&#39;enregistrement <ol><li> Fabriquer pipettes de patch en verre aluminosilicate (résistance à la pipette 2-5 MQ) dans un extracteur micropipette P-87. Conception pipette en patch de telle sorte que la pointe de pipette comprend diamètre de terminaison présynaptique entier. </li><li> PDMS patch manteau pipettes par trempage de la pipette de patch sous 50-60 psi de pression dans PDMS 23 (joindre un tube en silicone, 0,89 mm de diamètre intérieur, relié à une bouteille de gaz d&#39;azote, à l&#39;extrémité arrière de la pipette de patch) et séchez-les avec une chaleur pistolet. Alternativement, manteau manuellement la pipette avec PDMS, l&#39;application de revêtement à proximité de la pointe que possible, sous un microscope composé. </li><li> Feu pipettes de patch vernis à l&#39;aide d&#39;un microforge (un filament de platine sur mesure monté sur la scène d&#39;un microscope composé). </li><li> Identifier les axones isolés montrant terminaisons présynaptiques marqués par microscopie de fluorescence. </li><li> Remplir solution d&#39;enregistrement (conçu pour isoler des courants de Ca2 +, 10 mM de CaCl 2 ou BaCl 2 90 mM en tant que porteur de charge, tampon HEPES pH 7,6, osmolarité de 270 mOsm) dans la pipette de patch à l&#39;aide d&#39;une seringue. </li><li> Insérez la pipette en patch dans le porte-pipette et position au-dessus de bain en utilisant un manipulateur MP225 motorisé. Abaissez doucement la pipette de patch dans le bain et la position contre la face d&#39;un terminal présynaptique fluorescence identifié. </li><li> Avancer la pipette de patch lentement jusqu&#39;à ce que le contact est établi avec la membrane. A ce stade, de réaliser un joint d&#39;étanchéité par gigaohm douce bouche d&#39;aspiration à travers un tube relié au support de pipette. </li><li> Pour atteindre les niveaux de bruit de fond extrêmement bas requises pour l&#39;enregistrement monocanal Ca2 + courants, utiliser un Axopatch 200B avec un headstage refroidi pour les enregistrements. Les données d&#39;échantillon à 20-50 kHz et le filtre à l&#39;aide d&#39;un filtre de Bessel 5 kHz. Effectuer l&#39;acquisition de données en utilisant un Axograph X. </li><li> Utilisez un protocole étape standard, par incréments de 10 mV comme stimulus. Intégrer une pré-impulsion dans le protocole précédant le protocole de l&#39;étape, pour assurer activation maximale des canaux de Ca. Intégrer une mV étape 10 de fuite dans le protocole de l&#39;étape de post-analyse soustraction des courants de fuite. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Notre protocole de dissociation est importante en cédant axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins fonctionnelle présynaptique bornes Figure 4c et figure 4d. L&#39;absence de processus post-synaptiques qui s&#39;opposent à la terminaison présynaptique permet l&#39;accès de l&#39;enregistrement direct sur la membrane libération présynaptique visage dans les terminaux présynaptiques simples,...

La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide et précise. Action éventuelle invasion de la terminaison présynaptique conduit à l&#39;ouverture de VGCCs situés dans la membrane de presse du visage, l&#39;augmentation résultante présynaptique Ca2 + agissant comme déclencheur pour la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs 1. Toutes ces étapes se produisent dans des centaines de microsecondes 2, et donc nécessitent un couplage spatial serré de VGCCs à la fusion des vésicules machines 3. Présynaptiques flux de Ca2 + ont été caractérisées principalement par imagerie approches utilisant des colorants sensibles 4 de Ca. L&#39;incorporation de Ca2 + tampons qui modulent Ca2 + dans les neurones présynaptiques a été utilisée pour caractériser la relation entre indirectement calcium présynaptique et la neurotransmission 3. En outre, la modulation de la concentration de Ca2 + libre présynaptique par uncaging Ca2 + 5 ou enregistrement macroscopic courants de Ca2 + ont été utilisés en conjonction avec les mesures de fusion et / ou la libération des vésicules; telles que les mesures de capacité 6 ou post-synaptiques réponses 2 pour répondre à la même question. Cependant, la caractérisation de Ca2 + courants directement à la face de sortie, la section spécialisée de la membrane présynaptique où dépolarisation de la membrane est traduit en Ca2 + courants de déclenchement fusion des vésicules synaptiques et la libération de neurotransmetteurs, fait partie intégrante de l&#39;obtention d&#39;une mesure précise de la Ca2 + exigence de fusion des vésicules synaptiques. En outre, la capacité à caractériser directement Ca2 + courants à terminaisons présynaptiques individuels, couplé permet avec des mesures simultanées précises de la fusion des vésicules et la libération d&#39;une explication précise de la relation de synchronisation entre l&#39;évolution dans le temps du potentiel d&#39;action, présynaptique Ca2 courant, la fusion des vésicules et la libération. L&#39;accès à la membrane de presse de visagen&#39;est pas disponible dans la plupart des terminaisons présynaptiques en raison de fermer l&#39;apposition par les dendrites post-synaptiques. Cette inaccessibilité a été un obstacle majeur dans la caractérisation des VGCCs car elle empêche des mesures directes de courant dans les terminaux présynaptiques individuels. La caractérisation directe de présynaptiques Ca2 + courants dans les terminaux présynaptiques individuels a donc pas été possible dans les synapses centrales et n&#39;a été atteint que dans deux terminaux présynaptiques de type calyceal; calice de type synaptique des poussin ganglion ciliaire 7-10 et rat calices 11,12. Dans tous les autres terminaux présynaptiques dont la synapse réticulo géant dans la lamproie moelle épinière 13, le manque d&#39;accès à la membrane libération présynaptique visage a nécessité l&#39;utilisation d&#39;approches indirectes telles que Ca de l&#39;imagerie pour étudier présynaptiques flux de Ca2 +. <img alt="Figure 1" fo: contenu width = &quot;5 pouces&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figure 1 lamproie géante synapse réticulo. (A) Section de la lamproie de la moelle épinière pour indiquer l&#39;orientation dorso-ventral. Axones réticulospinaux sont marqués avec astérisque vert. (B) la reconstruction 3-D de la synapse réticulo dans la lamproie moelle épinière montrant axone présynaptique réticulo faire de nombreux contacts en d&#39;Passant (indiqués par des flèches vertes) sur le neurone post-synaptique 13. Terminaisons présynaptiques ont été marquées avec Alexa Fluor 488 hydrazide phalloïdine conjuguée (vert), alors que le neurone post-synaptique a été rempli avec Alexa Fluor 568 hydrazide (rouge). Lamproie géants axones réticulospinaux, situés dans la région ventrale de la moelle épinière parallèle à la rostrale-caudale axe Figure 1a, forme multiple en contacts synaptiques sur les neurones Passant de lacorne ventrale de la moelle 14 Figure 1b 13. Cellules entières macroscopique Ca2 + courants ont été enregistrés à partir des axones réticulospinaux dans la moelle épinière intacte 13,15. Cependant, les tentatives précédentes aveugles à la mesure directe de Ca2 + courants dans les axones réticulospinaux à la lamproie moelle épinière intacte en utilisant la technique de patch-clamp cellule attachée se sont révélées inefficaces 13 en raison du manque d&#39;accès à la membrane libération présynaptique de visage grâce à des processus post-synaptiques opposées Figure 1b. La membrane de la face de presse a été préalablement rendu accessible en enlevant le neurone post-synaptique 11, la perturbation mécanique de la synapse 12 avant l&#39;enregistrement ou le traitement enzymatique associée à la dissociation mécanique 16. Compte tenu de l&#39;organisation complexe de la moelle épinière, il s&#39;avérerait extrêmement difficile d&#39;identifier le neurone post-synaptique et retirer mécaniquement ou perturber ee synapse. Par conséquent, nous avons décidé d&#39;utiliser un traitement enzymatique 17 suivie par dissociation mécanique. En utilisant cette approche, nous avons développé une préparation très dissociés de la lamproie de la moelle épinière qui donne viables axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de tout processus post-synaptiques, fournissant ainsi un accès illimité aux terminaisons présynaptiques individuels. En collaboration avec un microscope standard inversé et l&#39;imagerie de fluorescence, il nous permet d&#39;identifier et de cibler les terminaux présynaptiques par fluorescence identifié individuels, avec une pipette de patch contenant une solution d&#39;enregistrement qui isole Ca2 + courants figure 4C et la figure 4d, pour l&#39;enregistrement en utilisant Cell- attaché technique voltage-clamp. Ca2 + courants ont été enregistrés directement sur ​​la membrane de presse du visage présynaptique des terminaisons présynaptiques individu Figure 4f. Il s&#39;agit d&#39;une significant percée dans le domaine de la transmission synaptique, car il est le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

La transmission synaptique est un processus extrêmement rapide. potentiel d&#39;action entraînée afflux de Ca2 + dans la terminaison présynaptique, à travers les canaux calciques voltage-dépendants (VGCCs) situés dans la membrane de la face de sortie, est le déclencheur de la fusion des vésicules et la libération de neurotransmetteurs. Cruciale pour la rapidité de la transmission synaptique est la synchronisation spatiale et temporelle entre l&#39;arrivée du potentiel d&#39;action, VGCCs et le mécanisme de libération de neurotransmetteur. La possibilité d&#39;enregistrer directement des courants Ca2 + de la membrane de presse du visage de terminaux présynaptiques individuels est indispensable pour une compréhension précise de la relation entre présynaptique Ca2 + et la libération de neurotransmetteurs. L&#39;accès à la membrane libération présynaptique visage pour l&#39;enregistrement électrophysiologique n&#39;est pas disponible dans la plupart des préparations et Ca 2 + présynaptique entrée a été caractérisé en utilisant des techniques d&#39;imagerie et MeasureMe courant macroscopiquents - techniques qui n&#39;ont pas une résolution temporelle suffisante pour visualiser Ca l&#39;entrée. La caractérisation de VGCCs directement à terminaisons présynaptiques simples n&#39;a pas été possible dans les synapses centrales et a jusqu&#39;ici été atteint avec succès que dans la synapse de type calice du ganglion ciliaire poussin et dans les calices de rat. Nous avons abordé ce problème avec succès dans la synapse réticulo géant de la lamproie de la moelle épinière par le développement d&#39;une préparation très dissociés de la moelle épinière qui donne axones réticulospinaux isolés avec des terminaux présynaptiques fonctionnelles dépourvues de structures post-synaptiques. Nous pouvons fluorescence étiqueter et identifier les terminaux présynaptiques individuels et les cibler pour l&#39;enregistrement. Utilisation de cette préparation, nous avons caractérisé VGCCs directement à la face de sortie de terminaux présynaptiques individuels en utilisant l&#39;immunohistochimie et d&#39;électrophysiologie approches. Ca2 + courants ont été enregistrés directement à la libération visage membrane oterminaisons présynaptiques individuels f, le premier enregistrement à effectuer au niveau des synapses centrales.

<html> Ce protocole donne de dissociation sains et fonctionnels axones réticulospinaux isolés dépourvus de post-synaptique projections Figure 2f, mais qui conservent néanmoins des terminaisons présynaptiques fonctionnels capables de vésicule synaptique évoquée exo-endocytose et la figure 4c et figure 4d. Les articles des régions isolées des axones réticulospinaux peuvent être clairement identifiés en microscopie optique d&#39;être clair, d&#39;autres procé...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l&#39;enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vues.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Vidéo: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zone sous-ventriculaire Fr-face: Coloration Wholemount et Flow épendymaire

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

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Neurosciences

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Mesure vertébrale présynaptique inhibition chez la souris par la racine dorsale enregistrement potentiel<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones