Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A_141007). Markus Saxer a fourni un appui technique.

Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive du Conseil Communautés européennes du 22 Septembre 2010 (2010/63 / UE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses. 1 Mise en place de cultures organotypique Entorhino-hippocampiques <ol><li> Préparer organotypiques cultures tranche de entorhino-hippocampique (de EHOSCs) de chiots jour 4 (P4) de souris postnatales utilisant la méthode statique d&#39;incubation 4,11. Ici, utiliser des souris C57BL6 et CB6F1. <ol><li> Prenez environ 30 minutes par chiot de la souris pour la préparation des cultures de tranche, soit 3 h pour une portée de 6 chiots de souris. Effectuer toutes les mesures dans des conditions stériles dans un plan de travail à flux laminaire avec des instruments chirurgicaux stérilisés. </li><li> Afin d&#39;éviter une interférence possible de la position de la tranche le long de l&#39;axe septo-temporelle, en utilisant uniquement de l&#39;hippocampe des tranches de la moitié du septum. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à la température ambiante. </li></ol></li><li> Coupez til la tête d&#39;un chiot P4 de la souris avec des ciseaux chirurgicaux. Aucune anesthésie n&#39;est nécessaire pour cette étape. <ol><li> Retirez le crâne autour du cerveau et identifier la fissure entre l&#39;extrémité caudale des hémisphères cérébraux et le mésencéphale. Retirez délicatement la partie de la rostrale du cerveau pour le mésencéphale du crâne et de le placer dans le milieu de la préparation glacée composé de MEM complété avec une forme stabilisée de L-glutamine. </li></ol></li><li> Poursuivre la dissection sous un stéréomicroscope avec le cerveau étant immergé dans le milieu de préparation à froid de glace. Retirer méninges restantes des hémisphères corticaux. Identifier l&#39;hippocampe à la surface caudale interne de l&#39;hémisphère et le séparer avec le cortex entorhinal adjacent du reste du cerveau. <ol><li> Transférer le tissu à un broyeur de tissus et de coupe de 400 pm d&#39;épaisseur des tranches dans des conditions aseptiques transversal à l&#39;axe septo-temporal de l&#39;hippocampe. </li></ol></li><li> Placer les tranches sur CEinserts de culture ll (environ 6 tranches par plaquette) et les incuber dans des plaques 6 puits avec 1 ml par puits de milieu d&#39;incubation (47 ml de MEM, 25 ml de milieu Eagle, 25 ml de sérum de cheval, 1 ml glutamax I, 1 ml d&#39;une solution stérile à 10% de glucose, pH 7,3) dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 à 37 ° C. Changer le support le lendemain, puis tous les deux jours jusqu&#39;à 1 semaine. </li></ol> 2 In Vitro L&#39;hypoxie et l&#39;oxygène-glucose privation de reperfusion <ol><li> Voir le tableau 1 pour un échéancier précis de la procédure. EHOSCs de culture pendant 5 jours (DIV5) avant l&#39;exposition à l&#39;hypoxie ou d&#39;autres ministères. A ce point de temps de changer de support de milieu d&#39;incubation contenant du sérum de cheval à 25% de milieu sans sérum avec la composition suivante: milieu Neurobasal avec supplément de 2% de B27, 1% de glutamax supplémentaire et 0,1% de glucose. </li><li> Préparer le milieu d&#39;autres ministères comme indiqué dans la référence 7 .Les concentrations finales des composants sera la suivante: 0,3mM CaCl 2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM NaHCO 3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4, et 10 mM de saccharose à pH 6,8. Ajouter 1 ml de milieu AM à chaque puits de deux plaques de culture tissulaire à 6 puits. <ol><li> Perfuser le milieu AMG avec N 2 pendant 1 heure dans une chambre d&#39;hypoxie et puis sceller et garder O / N dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Utiliser des bandes anaérobies comme indicateurs hypoxiques. Pensez aux médias d&#39;être l&#39;oxygène libre lorsque la couleur des bandes a changé du rose au blanc. </li><li> Pour l&#39;induction de l&#39;hypoxie, utiliser un milieu sans sérum de glucose au lieu de milieu des autres ministères. Avant utilisation, le milieu de perfuser N 2 dans une chambre à l&#39;hypoxie tel que décrit ci-dessus pour le milieu OGD. </li></ol></li><li> Avant que les tranches sont exposées à la OGD, perfuser le milieu OGD nouveau avec N2 pendant 30 min. Ajouter 2 ul de 1 mg / ml d&#39;iodure de propidium (PI) solution par puits (pour une concentration finale de 2 pg / ml) pour les tranches pendant 30 minutes et sélectionnerseulement tranches saines pour l&#39;expérimentation comme indiqué par un faible nombre de cellules positives PI. </li><li> Utilisez le calendrier de l&#39;exposition des autres ministères et la reperfusion indiqué à la figure 1. Priver tranches de soit que l&#39;oxygène (hypoxie) ou de l&#39;oxygène et du glucose (OGD) pendant 15 min. <ol><li> Pour l&#39;induction de l&#39;hypoxie ou d&#39;autres ministères, transférer tranches dans le milieu des autres ministères et garder pendant 15 min dans la chambre de l&#39;hypoxie. Assurez-vous que tous les fluides qui restent sur les côtés de l&#39;insert sont aspirés loin lorsque les cultures sont passés du milieu régulier à moyen OGD et le dos. </li><li> Après l&#39;hypoxie ou d&#39;autres ministères, remplacer le milieu AMG avec un milieu exempt de sérum oxygéné et cultures sont autorisés à récupérer pour 3, 24 ou 48 heures dans un milieu sans sérum dans l&#39;incubateur régulière à 37 ° C avec 5% de CO 2. Ajouter PI nouveau avant la fixation de la détermination de la mort cellulaire. </li></ol></li></ol> 3. traitements pharmacologiques de Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche <ol><li> CulturEHOSCs e pendant 5 jours (DIV5) dans du milieu d&#39;incubation avant l&#39;exposition à des traitements pharmacologiques. Lancer traitements pharmacologiques, soit pendant ou immédiatement après l&#39;OGD OGD quand les tranches sont transférées dans un milieu sans sérum. </li><li> Les traitements pour la protection des autres ministères. <ol><li> Ajouter 100 uM 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) ou 1 uM de tétrodotoxine (TTX) au milieu de culture au cours de l&#39;induction OGD (pendant 15 min) ou immédiatement après l&#39;induction AM pendant 30 min. Ensuite, incuber dans normoxique milieu sans sérum pendant 48 heures avant fixation. </li></ol></li><li> Traitements pour l&#39;induction de la mort excitotoxique. <ol><li> Après 5 jours d&#39;incubation de cultures de commutation de milieu de milieu sans sérum contenant 100 uM (RS) -α-amino-3-5-méthyl-4-hydroxy-isoxazolepropionique (AMPA) pendant 30 min. </li><li> Retirez le milieu de culture contenant AMPA par aspiration (prendre soin d&#39;enlever tout moyen résiduel sur inserts), puis transférer les tranches de nouvelles plaques avec un milieu exempt de sérum normal etles garder pendant 48 heures jusqu&#39;à ce que la fixation. </li></ol></li></ol> 4. fixation et Immunocoloration Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche <ol><li> L&#39;iodure de propidium (PI) coloration. <ol><li> Ajouter PI pendant 30 minutes dans le milieu de culture de tranches vivant à une concentration de 2 ug / ml. Voir cultures vivantes avec un microscope inversé équipé d&#39;une optique de fluorescence et sélectionnez tranches pour d&#39;autres traitements. Pour la coloration PI en combinaison avec l&#39;immunohistochimie, ajouter une solution de PI 30 min avant la fixation des cultures. </li></ol></li><li> Fixation des tranches. <ol><li> Retirer le milieu de culture à partir de la plaque à 6 puits et ajouter 3 ml fraîchement préparée de 4% de paraformaldehyde (PFA) à chaque puits. Ensuite, placez la plaque de 6 puits dans un réfrigérateur et fixer O / N à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution de PFA le jour suivant et se laver les tranches 3-4 fois avec du tampon phosphate salin (PBS). </li></ol></li><li> L&#39;élimination des tranches à partir de la culture de la cellule insert et procédure de blocage pour l&#39;immunohistochimie de sections flottantes. <ol><li> Détacher délicatement et retirez les tranches des inserts de culture en utilisant une peinture art pinceau de la taille 0 ou moins. Transférer chaque tranche individuelle dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits rempli de tampon de blocage (PBS avec 3% de sérum normal de chèvre (NGS) et 2% de Triton-X100). Conserver les tranches dans le tampon de blocage pendant 2 h à température ambiante sous agitation constante par un agitateur orbital. </li></ol></li><li> Immunocoloration des cultures tranche <ol><li> Pour le marquage des vaisseaux sanguins utilisent anti-laminine polyclonaux à une dilution de 1: 200 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100. </li><li> Pour les neurones d&#39;étiquetage utilisent anti-protéine 2 associée aux microtubules (MAP 2) à une dilution de 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100. </li><li> Incuber les tranches avec des anticorps primaires pendant 48 heures à 4 ° C avec agitation constante. Après la période d&#39;incubation, les laver dans du PBS avec 0,5% de Triton-X100 à 4.3 fois. </li&gt; <li> Anticorps secondaires Diluer 1: 500 dans du PBS contenant 1% de NGS et 0,5% de Triton-X100. Incuber les tranches pendant 2 heures à la température ambiante dans l&#39;obscurité avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa fluorophores. Utilisez le chèvre anti-lapin approprié ou anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à Alexa 350 ou 488. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire et laver les tranches à trois reprises avec une solution saline tamponnée au Tris (TBS); monter sur des lames de verre et lamelle les diapositives avec Mowiol. </li></ol></li><li> Microscopie des coupes colorées </li><li> Voir les coupes colorées soit sur un microscope standard avec un équipement à épifluorescence ou avec un microscope confocal. Prenez des photos avec un appareil photo approprié. Pour certaines images, inverser le contraste de fluorescence afin de produire des navires sombre colorées sur un fond lumineux (figures 5 et 6). </li></ol> 5 Détermination de la densité du navire régional dans les cultures <ol><li> Quantifier la vessel densité basé sur les passages de navires comme décrit dans la référence 8. </li><li> Utilisez coupes colorées pour la laminine pour ces mesures. Superposer les images enregistrées de grossissement de 10X avec une grille 6 x 6, où chaque grille est égale à 100 x 100 um par mètre carré, champ total de 0,25 mm 2. </li><li> Superposer trois de ces réseaux dans la région CA1, CA3, DG, et CE (figure 2). Comptez le nombre de navires traversant les lignes de la grille. </li><li> Pour obtenir des résultats avec un bon niveau de pertinence statistique, effectuer des mesures dans au moins trois expériences indépendantes, chacune comprenant des données à partir de 3 souriceaux avec 3 tranches par chiot de la souris. </li><li> Déterminer la valeur moyenne de passages de navires dans les grilles de chaque région et d&#39;effectuer une analyse statistique par ANOVA avec correction de Bonferroni comme test post hoc (p &lt;0,05 défini comme significatif) en utilisant un logiciel de statistique appropriée. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Les expérimentations animales ont été effectuées conformément à la directive du Conseil Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses. Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Avec les méthodes présentées ici, les cultures organotypiques d&#39;hippocampe de tranche peuvent être utilisés comme un outil polyvalent pour étudier les changements en matière plastique dans le tissu neuronal après une blessure. Bien que les cultures de tranches organotypiques ont été utilisés dans le passé pour l&#39;étude de réactions neuronales après une ischémie de 6, 7, du nouvel aspect de l&#39;étude simultanée de changements vasculaires améliore considérablement les applications p...

Le système nerveux central est particulièrement sensible à une perte ou une réduction de l&#39;oxygène et de glucose alimentation par le système vasculaire. Même une assez courte interruption de l&#39;approvisionnement en sang au cerveau peut provoquer une perte permanente de la fonction des zones du cerveau concernées mènent aux syndromes de temps typiques. En plus de la perte neuronale dans les zones touchées primaires, il existe généralement une perte neuronale retardée supplémentaire à travers des dommages secondaires. Malheureusement, jusqu&#39;à présent, aucun traitement neuroprotecteur pour la réduction de la mort neuronale secondaire était disponible 1. Les efforts de recherche pour étudier les mécanismes de dommages secondaires reposent sur ​​l&#39;utilisation de modèles animaux d&#39;ischémie cérébrale comme l&#39;occlusion de l&#39;artère cérébrale moyenne et diverses techniques d&#39;occlusion thrombotique (pour une revue récente, voir 2). En parallèle, également en raison de limitations d&#39;ordre éthique avec l&#39;utilisation de modèles animaux, la culture organotypique de divers tissus du système nerveux central ont été utilisés qui permettent à l&#39;étudy de réactions neuronales à différents types de blessures 3-5. Pour l&#39;étude de la réaction neuronale dans des conditions qui imitent les lésions cérébrales ischémiques, le système de modèle de privation d&#39;oxygène et de glucose (OGD) a été développé. Dans ce modèle, les cultures de tranches sont temporairement exposées à un milieu dépourvu de glucose et a été équilibrée avec de l&#39;azote gazeux en l&#39;absence d&#39;oxygène. Avec un tel traitement, il est possible d&#39;induire une lésion neuronale et la perte qui est assez similaire à celui observé après une lésion ischémique in vivo 6, 7. Dans l&#39;hippocampe, ce traitement induit une perte neuronale dans CA1 spécifiquement, mais pas dans l&#39; région CA3 ou le gyrus denté de l&#39;hippocampe. En revanche, l&#39;étude des réactions vasculaires dans des cultures de tranches jusqu&#39;à présent n&#39;a pas été largement engagé. Une raison évidente est l&#39;absence de circulation et de perfusion vaisseau sanguin dans le modèle de culture de la tranche. Cependant, nous avons montré précédemment qu&#39;il est possible de maintenir bvaisseaux Lood du SNC tranche cultures pendant plusieurs jours 8, 9. L&#39;objectif global de cette méthode est de surveiller non seulement le sort des neurones après les autres ministères mais étendre l&#39;étude sur le sort et le remodelage du système vasculaire qui est une partie importante de la réponse de blessure. Jusqu&#39;à présent, de telles études ont nécessité l&#39;utilisation de l&#39;expérimentation animale (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). Dans le protocole présenté ici, nous allons détailler la façon dont ces études peut être fait dans les cultures organotypique entorhino-hippocampique attaqué ni à l&#39;hypoxie ou par des lésions excitotoxiques suivie d&#39;une analyse des deux réactions de survie et des vaisseaux sanguins neuronales. Ce protocole est basé sur une étude publiée précédemment sur ​​ce sujet 10 et peut être utile pour tout laboratoire s&#39;intéresse aux interactions neurovasculaires dans le SNC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Lésion cérébrale ischémique est parmi les affections les plus courantes et les plus dévastatrices de compromettre le bon fonctionnement du cerveau et conduit à la persistance des déficits fonctionnels chez les patients atteints souvent. Malgré les efforts de recherche intensifs, il n&#39;y a toujours pas de traitement efficace disponible qui réduit une lésion neuronale et protège les neurones dans les zones ischémiques du secondaire mort retardée. La recherche dans ce domaine implique généralement l&#39;utilisation de modèles animaux élaborés et problématiques. Cultures organotypique Entorhino-hippocampique contestées par manque d&#39;oxygène et de glucose (OGD) sont établis dans des modèles in vitro qui imitent l&#39;ischémie cérébrale. Le nouvel aspect de cette étude est que les modifications des vaisseaux sanguins du cerveau sont étudiés, en plus de modifications neuronales et la réaction à la fois le compartiment et le compartiment neuronal vasculaire peut être comparée et corrélée. Les méthodes présentées dans ce protocole d&#39;élargir considérablement les applications potentielles de la ouganotypic approche de la culture de la tranche. L&#39;induction de l&#39;hypoxie ou OGD seul peut être appliquée par des moyens relativement simples dans des cultures de tranches organotypiques et entraîne des dommages fiable et reproductible dans le tissu neural. Ceci est en contraste frappant avec les expériences sur les animaux complexes et problématiques induisant accident vasculaire cérébral et ischémie in vivo. En élargissant l&#39;analyse pour inclure l&#39;étude de la réaction du système vasculaire pourrait fournir de nouveaux moyens sur la façon de préserver et de restaurer les fonctions cérébrales. L&#39;approche de la culture de la tranche présentée ici pourrait se développer en un outil intéressant et important pour l&#39;étude des lésions cérébrales ischémiques et pourrait être utile pour tester des mesures thérapeutiques potentielles visant à la neuroprotection.

Privation d&#39;oxygène et de glucose hypoxie induisent la mort neuronale et de la réduction d&#39;un vaisseau sanguin en particulier dans la région CA1 de l&#39;hippocampe. OGD ou la privation de l&#39;oxygène seul pendant 15 min ont induit une forte induction de la mort cellulaire comme on le voit par l&#39;iodure de propidium en particulier dans la zone CA1 de l&#39;hippocampe (figure 3) similaire à celle décrite précédemment 7. Avec les marqueurs de visualiser le r...

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The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K vues.  University of Basel.  Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure. 

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Recherche

Neurosciences

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...