Nous tenons à remercier particulièrement Monique Nenniger Tosato pour son excellent support technique ainsi que Jean-Yves Chatton pour ses conseils scientifiques et la plate-forme d&#39;imagerie CIF de l&#39;UNIL pour l&#39;équipement de microscope. Le financement a été fourni par le Fonds national suisse.

1. Dissection de la souris VNO <ol><li> Utilisez la souris adulte. Comme phéromone de détection est impliqué dans multimodalities, distinguer soigneusement entre les souches, les génotypes, les sexes et les âges est importante et va influencer vos résultats. Ici, nous choisissons souris adultes VG 30 précédemment utilisés pour l&#39;identification d&#39;une paire phéromone-récepteur (2-heptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A). </li><li> Avant de commencer la dissection, préparer douce froide artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO 3 25 mM, D-glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturé avec oxycarbon (95% d&#39;O 2: 5% de CO 2). Pour cela, mélanger tous les composants, sauf ACSF CaCl 2. Saturer la solution par barbotage directement avec oxycarbon. À la fin, ajouter le CaCl 2 et d&#39;ajuster avec ddH 2 0 au volume désiré. Conserver la solution ACSF sur la glace jusqu&#39;à ce que uSE. </li><li> L&#39;euthanasie de la souris doit être préférentiellement réalisée par dislocation cervicale ou par inhalation de CO 2, juste avant l&#39;expérience. </li><li> Couper la tête de la souris. Placez-le sous un microscope à dissection au froid en permanence oxycarbonated ACSF. </li><li> Couper la mâchoire inférieure et la position de la tête afin de visualiser le palais (Fig. 1B). </li><li> Faire une incision horizontale dans la partie supérieure du palais (Fig. 1B) avec des ciseaux micro et retirer la membrane en bouche avec micro pince à disséquer. Hydrater et nettoyer la cavité exposée avec ACSF (Fig. 1C). </li><li> Couper la partie supérieure et la partie inférieure de la cloison nasale (Fig. 1C). Délicatement extraire la cloison nasale contenant le VNO et le placer directement dans l&#39;ACSF sur la glace (Fig. 1D). </li><li> Séparés verticalement les deux parties du VNO à l&#39;aide de micro pince à disséquer et délicatement retirer la capsule cartilagineuse du VNO (Fig. 1E). Assurez-vous que toutes les pièces cartilagineuses sont supprimés. </li></ol> 2. Préparation VNO coupe de tissu La préparation VNO tranche de tissus décrits dans cette section 2) est principalement pour les enquêtes imagerie calcique. Tranches VNO peut aussi être utilisé pour immunohistostainings sur des tranches flottantes pour vérifier l&#39;intégrité structurelle du tissu (s&#39;il vous plaît voir la section 3) du Protocole). <ol><li> Préparer bas point de fusion de gélose (3% de la norme PBS) et votre lieu de travail. Vous aurez besoin de l&#39;ACSF, un microtome et des supports, micro pince à disséquer, l&#39;intégration de moules (22 x 22 x 20 mm), des lingettes de précision, des brosses, des plaques de culture tissulaire, cyanacrylat colle, glace et un thermomètre. </li><li> Remplissez le moule intégration avec 3% d&#39;agar bas point de fusion. Assurez-vous que la température n&#39;est pas supérieure à 41 ° C avant de les placer verticalement la peu effacé VNO (figure 2A) pour être en mesure d&#39;obtenir des tranches coronales. </li><li> Placer le moule sur la glace intégrationpendant 1 min jusqu&#39;à solidification et ensuite le séparer du bloc de gélose. Couper le bloc de gélose dans une forme pyramidale et placez-le avec de la colle sur le support microtome (figure 2B). </li><li> Couper les tranches coronales VNO avec le microtome, avec une vitesse de 0,5 mm / s, une amplitude de 0,7 mm et une épaisseur de 100 um à froid ACSF et de recueillir les tranches de tissu avec un pinceau avant de les placer dans une assiette remplie de culture de tissus par le froid ACSF. </li><li> Si vos tranches contiennent de fluorescence endogène comme la GFP (en génique ciblée les neurones), vous pouvez les sélectionner sous un stéréomicroscope fluorescentes (figure 2C). </li></ol> 3. Immunohistochimie sur coupes flottantes VNO Le but de cette procédure est de vérifier l&#39;intégrité des tranches de tissu VNO obtenus dans la section 2). Acétylé-tubuline est un marqueur de microtubules / cytosquelette exprimées dans les dendrites et les microvillosités des neurones sensoriels VNO. Pour des expériences d&#39;imagerie calcique, allez directionTLY à la section 4) du Protocole. La méthode immunohistostaining sur des tranches flottantes VNO peuvent être adaptés à l&#39;évaluation de l&#39;expression d&#39;une protéine d&#39;intérêt. À cette fin, nous vous recommandons de fixer le VNO pour 1h à 4 ° C dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) après le point 1.7) du protocole et de l&#39;utilisation de cette PBS à pH 7,6 points plutôt que solution de l&#39;ACSF. <ol><li> Dans la plaque de culture tissulaire, fixer vos tranches d&#39;intérêt dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) 1h à 4 ° C. </li><li> Bloc vos tranches de tissu une nuit à 4 ° C dans une solution de PBS contenant END (sérum normal de chèvre) 10% et le Triton X-100 à 0,5%. </li><li> Incuber tranches avec l&#39;anticorps primaire (anticorps anti-tubuline acétylée, souris, 1:2000) pendant 16 heures à température ambiante (TA) dans une solution de PBS contenant 5% de NGS et de Triton X-100 à 0,25%. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec une solution de PBS contenant 2% de NGS. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité avec le secoNdary anticorps (Cy5 conjugués de chèvre anti-souris, 1:200) dans une solution de PBS contenant 2% de NGS pour 1h à température ambiante. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS contenant 2% de NGS, PBS END 1% et PBS. </li><li> Mont vos tranches dans un média fluorescents montage (contenant ou non DAPI) en les plaçant au centre des zones délimitées hydrophobe (utiliser un stylo hydrophobe) et couvrir les tranches avec des lamelles. </li><li> Faire des observations et des acquisitions avec la microscopie confocale et un logiciel permettant des reconstructions 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Imagerie calcique sur des tranches de VNO <ol><li> Les procédures suivantes auront lieu dans l&#39;obscurité. Incuber tranches VNO pour 1h à 37 ° C dans une solution de chargement composé de froid ACSF avec Fura-deux heures (7 uM; solution stock de 1 mM dans le DMSO) et pluronic 0,1% (p / v; solution stock à 20% dans le trou DDH 2 O). </li><li> Gardez les tranches chargé sur la glace avec oxycarbonation jusqu&#39;à utilisation. Loaded tranches peuvent être conservés pour3-4h. </li><li> Placer les tranches de chargement avec une brosse dans une chambre de perfusion contenant ACSF et de maintenir les tranches avec une ancre coupe de tissu (figure 3A). </li><li> Placer la chambre de perfusion sur la scène d&#39;un microscope à l&#39;imagerie calcique (Fig. 3B) et en continu perfuser avec oxycarbonated ACSF à RT. La température peut être adaptée à l&#39;utilisation d&#39;un régulateur de température bipolaire. </li><li> Observations des tranches de VNO chargé (Fig. 3C-E) sont réalisées avec un microscope inversé à fluorescence, avec un objectif 25x ou 63x et un CooL SNAP-HQ caméra. L&#39;éclairage est fait de manière séquentielle (340/380 nm) avec un instrument polychromateur et enregistrés à une fréquence de 5Hz. D&#39;émission filtrée est fait à 510 nm. Intracellulaire de calcium changements de rapport (AF = 340 nm/380 nm) sont surveillés par un logiciel approprié. </li><li> Chemostimulation doit être choisi en fonction de vos propres fins expérimentales. Ici, des perfusions de ACSF contenant une phéromone mix (isobutylamine, la 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, diméthylpyrazine, α / β-farnésène, 10 -6 M), 2-heptanone (10 -6 M) ou fraîchement récoltés mâle et femelle (1: 1) l&#39;urine de souris (1:100) sont effectuées 32. Perfusion d&#39;ATP (125 uM) est utilisé comme un test de viabilité à la fin de l&#39;expérimentation (Fig. 3F) et devraient indiquer une proportion d&#39;environ 80% des neurones viables. Dans ces conditions, les tranches peuvent être utilisés jusqu&#39;à 2 heures. </li><li> Sous-populations GFP-tagged de neurones sensoriels sont visualisés par illumination spécifique (ici, les neurones exprimant V1rb2) et peuvent être analysées avec précision (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Pour établir un dosage fonctionnel pour enquêter sur la transduction du multi voies en prenant place dans le VNO souris, ou d&#39;identifier de nouvelles phéromones récepteurs paires, nous profitons de la ligne VG de la souris (fig. 1A </strong&gt;). Dans cette ligne, un sur les récepteurs V1Rs 240, le récepteur est V1Rb2 GFP-tagged permettant la visualisation facile d&#39;une sous-population particulière de neurones sensoriels voméronasal. Après extraction et la dissection de la VNO (figure 1E), nous préparons aiguë tranches VNO (figure 2C). Nous fixons une fraction d&#39;entre eux, afin de vérifier et de valider l&#39;intégrité tissulaire de la préparation en effectuant immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline (Fig. 2D-F). L&#39;autre fraction des tranches est utilisé pour des expériences d&#39;imagerie calcique. Pour cela, les tranches sont chargés avec Fura-2 heures (Fig. 3C-E) et le niveau de calcium intracellulaire de chaque neurone est surveillé comme un ratio AF (figure 3F). Viabilité des neurones est évaluée par la perfusion d&#39;ATP (125 uM), après quoi augmentation rapide et transitoire du ratio AF est attendu (figure 3F). L&#39;urine étant une source importante de phéromones, la perfusion de produits fraisl&#39;urine de souris Ly collectées (1:100) est utilisé comme un contrôle endogène. Il déclenche transitoires calciques dans environ 50% des neurones enregistrés (cellules 1 et 2, Fig. 3F). Sous un éclairage GFP, V1Rb2 neurones positifs sont observables, et la perfusion de son ligand phéromonal connue, la 2-heptanone, initie l&#39;activation cellulaire (cellule 1, Fig. 3I). Fait intéressant, les activations neuronales sont également observables en une fraction de neurones qui n&#39;expriment pas le récepteur V1Rb2 (neurones GFP négatifs) (cellule 2, fig. 3I), démontrant la complexité de la phéromone de codage dans le VNO. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection de l&#39;organe voméronasal de la souris. (A) Une souris à partir de la ligne VG. (B) Après l&#39;euthanasie de la souris, la tête pleine est placé sous un microscope binoculaire et la mâchoire inférieure est enlevée afin de visualiser le palais. Une petite incision horizontale est faite(Ligne noire en pointillés). (C) Après l&#39;enlèvement du voile du palais, la cloison nasale alignés avec le VNO est coupé dans la partie supérieure et la partie inférieure (blanc pointillé) pour faciliter l&#39;extraction VNO. (D) Le VNO est positionné dans une solution de l&#39;ACSF et séparés (insérer: Vue de puissance plus élevé des deux parties). (E) La capsule cartilagineuse du VNO est délicatement retiré, et le VNO sans capsule cartilagineuse est utilisé pour le reste de l&#39;expérimentation. Barres d&#39;échelle sont les suivants: BE, 1 mm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figure 2. Souris voméronasal préparation de tranches aiguës et de l&#39;intégrité tissulaire. (A) Le VNO est verticalement intégré la souris dans une solution d&#39;agar à 3%. La température de la gélose doit être inférieure à 41 ° C. (B) Le bloc d&#39;agar est coupé en une forme pyramidale et 100 um sections VNO (ligne noire en pointillés) sont générés dans l&#39;ACSF. (C) tranches VNO peut être sélectionné sous un stéréomicroscope fluorescentes afin de visualiser un particulierpopulation de neurones sensoriels marqués. (DF) de l&#39;intégrité tissulaire peut être évalué par immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline, une vue plus grande puissance de l&#39;V1rb2 génique ciblée les neurones de démontrer la parfaite conservation de la préparation. Neurones avec leurs dendrites longues atteignant la surface de la lumière (E) ainsi que l&#39;expression de la protéine structurelle des boutons dendritiques et microvillosités peuvent être observées (F). Barres d&#39;échelle sont les suivantes: B, 5 mm; C, 60 um; D, 40 um; EF, 20 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Imagerie calcique Figure 3. Et la détection des phéromones dans les tranches de tissu voméronasal aiguë. (A) Après un Fura-2 heures phase de chargement, des tranches de VNO sont placés dans une chambre de perfusion et sont maintenues avec une ancre adaptée (vue de forte puissance). (B) des expériences sont effectuées dans les tranches sombre et VNO sont continuellement perfusées avec ACSF à TA avec un système de vide. La température peut être chosfr en utilisant un système de régulateur de température composé d&#39;un élément bipolaire Pelletier et une sonde thermique. Cette expérience particulière a été réalisée à température ambiante. (CE) tranches VNO sont observables sous contraste de phase Hoffman (C, HV) ou l&#39;illumination Fura 380 nm avant (D) et lors de l&#39;activation neuronale (E, ici avec l&#39;ATP). (F) la viabilité neuronale est évalué avec une perfusion d&#39;ATP (125 pM). Ici, chemostimulation est fait avec de l&#39;urine (urine, 1:100) ou avec un mélange de phéromones de la souris (ph mix., 10 -6 M) à un débit constant de 165 ml / h. Les niveaux de calcium intracellulaire (AF) peuvent être enregistrées individuellement pour chaque cellule (cellule 1 à 3). (G) Un neurone V1Rb2 est visualisée sous un éclairage GFP (1). (H) Le chargement de ce neurone (1) ainsi que d&#39;un neurone non V1rb2 exprimer (2) est montrée. (I) Le neurone est V1rb2 mesure de répondre à la 2-heptanone avec une augmentation du calcium intracellulaire. Ce particulier la non-V1rb2 neurone répond également à exprimer la 2-heptanone (cellule 2). Barres d&#39;échelle sont: CE, 20 um; GH,15 um; AF = 340 nm / 380 nm. (F et I) Durée d&#39;application de relance est indiquée par des barres sous chaque trace. L&#39;échelle de couleurs arbitraires représente l&#39;intensité de fluorescence.

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P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode d&#39;imagerie calcique présenté ici permet d&#39;enregistrer, dans une préparation de tranches aiguës, les réponses des phéromones de neurones VNO souris. Avec cette approche, la dissection de l&#39;animal à l&#39;neurones voméronasal est, avec une certaine pratique, facilement réalisable et offre une préparation de tissu vivant longtemps. Il permet de temps des expériences comme les enquêtes pharmacologiques ou l&#39;étude du codage phéromonal. Avec cette technique, physiologiques, des populations importantes ainsi que des sous-populations précises de neurones peut être analysée spécifiquement. En outre, cette méthode peut être facilement adapté à des approches immunohistochimiques ou des expériences à base de colorants de calcium. L&#39;utilisation de ces méthodes combinées va sûrement permettre l&#39;identification de nouveaux ligands pour les phéromones chémorécepteurs orpheline de nombreux exprimée dans l&#39;organe voméronasal de la souris.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;adénosine 5&#39;-triphosphate disodique solution de sel (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> De façon préférentielle pour l&#39;immunohistochimie </td></tr><tr><td> Agar (bas point de fusion) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> De préférence pour l&#39;imagerie calcique </td></tr><tr><td> CL-100 Contrôleur de température bipolaire </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure chèvre anti-souris IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Protéger de la lumière </td></tr><tr><td> DMSO (diméthylsulfoxyde) </td><td> Merck </td><td> 317 275-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Incorporation de moules, de Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescent montage de médias (Vectashield avec DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-deux heures </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Protéger de la lumière </td></tr><tr><td> Glisseal N (graisse à vide, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Grand bain de chambre d&#39;enregistrement (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (logiciel pour l&#39;imagerie calcique; v.7.6.5.0) </td><td> Systèmes Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonaux anti-tubuline, acétylerd anticorps de souris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme pour les chambres (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (flacon doseur, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 chauffe double solution en ligne / Cooler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Ancrage Slice (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> PEN PAP Super (hydrophobestylo) </td><td> Pelco international </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93 420-250ml </td><td></td></tr><tr><td> Lame vibrante microtome VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome système à haute vitesse polychromateur </td><td> Systèmes Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane logiciels scientifiques </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson et Martin Lüscher utilisé la phéromone terme pour la première fois en 1959 pour décrire une chimiques utilisés pour la communication intra-espèces. Les phéromones sont volatiles ou non volatiles courte durée molécules sécrétées 2 et / ou contenus dans les fluides biologiques 3,4, tels que l&#39;urine est un liquide connu pour être une des principales sources de phéromones 3. La communication phéromonale est impliqué dans une variété de modalités d&#39;animaux tels que les interactions clés kin 5,6, 3 et les organisations hiérarchiques interactions sexuelles 7,8 et sont par conséquent directement corrélée avec la survie d&#39;une espèce donnée 9,10,11. Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l&#39;organe voméronasal (VNO) 10,12, une structure paire située à la base de la cavité nasale, et enfermé dans une capsule cartilagineuse. Chaque VNO a une forme tubulaire avec un lumen 13,14 permettant le contact avec les vérificateurs externesmonde chimique. Le neuroépithélium sensorielle est principalement composé de neurones bipolaires voméronasal sensorielles (VSN) 15. Chaque VSN s&#39;étend une dendrite unique pour la lumière se terminant en une poignée de grandes dendritiques portant jusqu&#39;à 100 microvillosités impliquées dans la détection chimique 16. Sous-populations de nombreux VSN sont présents. Ils sont différenciés par la chémorécepteurs qu&#39;ils expriment et donc éventuellement par le ligand (s) qu&#39;ils reconnaissent 17,18. Deux principales familles de récepteurs voméronasal, V1Rs et V2Rs 19,20,21,22, sont composés respectivement de 240 et 120 23 24 membres et sont exprimés dans des couches distinctes du neuroépithélium. Les récepteurs olfactifs (OR) 25 et les récepteurs de peptides formyl (FPRs) 26,27 sont également exprimés en VSN. Que ce soit ou non ces sous-populations neuronales utiliser la même voie de signalisation en aval des phéromones de détection est inconnue. Malgré un rôle majeur joué par un calcium-perméable canal (TRPC2) présents dans les microvillosités des neurones matures 28 TRPC2 canaux de transduction indépendante ont été suggérées 6,29. En raison du nombre élevé de sous-populations neuronales et la morphologie particulière de l&#39;orgue, les enquêtes pharmacologiques et physiologiques des éléments de signalisation présentes dans le VNO sont complexes. Ici, nous présentons une préparation tissulaire aiguë tranche de la VNO la souris pour effectuer des examens d&#39;imagerie calcique. Cette approche physiologique permet des observations, dans le milieu naturel d&#39;un tissu vivant, des sous-populations générale ou individuelle du VSN préalablement chargé avec Fura-deux heures, un colorant de calcium. Cette méthode est également commode pour étudier tout récepteur GFP-tagged phéromone et est adaptable pour l&#39;utilisation d&#39;autres sondes fluorescentes de calcium. Comme exemple, nous utilisons ici une souris VG ligne 30, dans laquelle la traduction du récepteur de phéromones V1rb2 est liée à l&#39;expression de la GFP par une stratégie polycistronique. </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l&#39;organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l&#39;imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d&#39;identification.

Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K vues.  University of Lausanne. Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l'organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l'imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d'identification.

Vidéo: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Recherche

Neurosciences

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: aiguë cerveau adulte trancher dans physiologique Température

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...