Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A-116 624).

1. La mise en place des cultures organotypiques cérébelleuse Slice Cultures tranche de cervelet sont préparés dès le premier jour post-natal 8 chiots P souris (8) en utilisant la méthode d&#39;incubation statique 10. Dans notre laboratoire, nous utilisons B6CF1 souris. Dans certaines expériences souris transgéniques ont été utilisés aussi qui expriment l&#39;EGFP sélectivement dans les cellules de Purkinje. La préparation des cultures tranche dure environ 30 minutes par chiot de souris, soit 3 heures pour une portée de 6 chiots souris. Toutes les étapes sont réalisées dans des conditions stériles dans un plan de travail à écoulement laminaire avec des instruments chirurgicaux stérilisés. <ol><li> Le cervelet des souriceaux P8 est disséqué par le cerveau en milieu de préparation glacée (MEM (Gibco Catalog No. 11012) avec glutamax 1:100, pH 7,3) en utilisant un stéréomicroscope. </li><li> Le cervelet est coupé en tranches épaisses 350 um dans l&#39;orientation sagittale en utilisant un tissue chopper McIlwain. </li><li> Les tranches sont placées sur Millipore inserts de culture cellulaire (env.6 tranches par insertion, Millipore PICM03050) et sont incubés dans des plaques 6 puits avec 0,75 ml par puits de milieu d&#39;incubation (48,35 ml de MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml de sérum de cheval, 1ml glutamax I, 0,65 ml d&#39;une solution de glucose stérile à 10% solution, pH 7,3) dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO 2 à 37 ° C. Tous les réactifs de culture de tissus provenaient de Gibco, Invitrogen. </li><li> Traitements pharmacologiques sont généralement démarrées à 3 jours in vitro (DIV3) en ajoutant le médicament dans la concentration désirée dans le milieu de culture. Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et (RS) -3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG) provenaient Tocris, Royaume-Uni. Comme de nombreux médicaments nécessitent l&#39;utilisation de DMSO ou de l&#39;éthanol pour préparer une solution stock (par exemple PMA) il faut veiller à ce que la quantité totale de solvant ajouté au milieu de culture ne dépasse pas 1% (7,5 pi par puits). Les médicaments sont renouvelés en même temps que le changement du milieu de culture tous les 2 ème ou 3 ème jour. </li></ol> 2. Fixation et Immunoscontenant des cultures organotypiques cérébelleuse Slice Un avantage important du cervelet est que les anticorps sont disponibles spécifiquement et joliment colorer les neurones cérébelleux principaux, à savoir les cellules de Purkinje et les cellules granulaires. La morphologie dendritique des cellules de Purkinje peut être révélée par immunomarquage avec des anticorps anti-calbindine D28K. <ol><li> Pour la fixation des cultures, le milieu de culture est éliminé et 3 ml de paraformaldéhyde 4% à froid dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) sont ajoutés avec précaution par puits contenant l&#39;insert Millicell avec les tranches de cervelet fixées à la membrane. Cultures sont fixées pendant une nuit, puis le fixateur est éliminé et les cultures sont rincées avec du tampon phosphate. </li><li> Pour immunologique des anticorps suivants sont utilisés: anticorps de lapin anti-calbindine D-28K (Swant, Bellinzona, Suisse) à 1:1000 pour visualiser sélectivement les cellules de Purkinje et les anticorps monoclonaux anti-neun (Chemicon, Millipore) à 1:500 pour visualiser sélectivement granuLe 12 cellules. Lapin anti-GFP était de Abcam, Royaume-Uni. Anticorps secondaires fluorescents Alexa étaient de Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> Les cultures sont perméabilisées et bloquée par addition de 3% de sérum de chèvre normal + 0,3% TritonX100 dans un tampon phosphate 0,1 M (solution de blocage). Anti-calbindine D28K et anti-NeuN sont dilués dans une solution de blocage et les cultures sont incubées avec la solution de blocage contenant les anticorps nuit à 4 ° C sous légère agitation. Toutes les dilutions sont indiquées en% (v / v), du Triton X100 est prise à partir d&#39;une solution mère à 10% afin de faciliter le pipetage. </li><li> Les cultures sont rincées 3 fois avec du tampon phosphate 0,1 M et sont ensuite incubées avec des anticorps secondaires appropriés, par exemple, de chèvre anti-lapin Alexa 568 et chèvre anti-souris Alexa 488 dilué à 1:500 dans 0,1 M de tampon phosphate + 0,1% TritonX100 pendant 2 heures à la température ambiante. Les cultures sont ensuite rincés 3 fois avec du tampon phosphate 0,1 M. </li><li> Les coupes colorées sont supprimées de la culturebien avec un pinceau et sont montées sur des lames de verre SuperFrost Plus et recouvertes avec un milieu de montage approprié, par exemple Mowiol. Les cultures peuvent maintenant être visionnées sur un microscope à épifluorescence régulière avec un équipement ou avec un microscope confocal. </li></ol> 3. Visualisation des cellules de Purkinje individuels dans les cultures organotypique <ol><li> Après immunomarquage avec calbindine D28k le cytoplasme des cellules de Purkinje complète est brillamment colorés dont les dendrites et l&#39;axone. En raison de l&#39;alignement dense de cellules de Purkinje dans la couche des cellules de Purkinje, les arbres dendritiques des cellules de Purkinje la plupart se chevauchent ce qui rend difficile d&#39;étudier la tonnelle complète d&#39;une cellule individuelle. Toutefois, en raison de la mort cellulaire de certaines cellules de Purkinje au cours du processus de préparation, dans de nombreuses cultures certaines zones sont présents avec une densité réduite des cellules de Purkinje. Dans ces zones, il est possible de trouver des cellules de Purkinje avec un arbre dendritique complet qui ne se chevauchent pas avec les autres caunes. Dans ces cellules, l&#39;arbre dendritique peuvent être visualisés et analysés dans une qualité comparable à une coloration de Golgi. Parce que dans le cervelet des cellules de Purkinje sont le seul type cellulaire exprimant calbindine D28K les cellules sont également identifiés comme les cellules de Purkinje. </li><li> Une autre méthode consiste à utiliser des cultures dérivées de B6; FVB-Tg (PCP2-EGFP) 146.244Yuza / J souris (appelé ici PCP2-EGFP souris, disponibles auprès de Jackson laboratoires) qui expriment l&#39;EGFP sous la cellule de Purkinje spécifique L7 promoteur 11. Dans les cultures tranche de vie de ces cellules de Purkinje peuvent être visualisées par l&#39;expression de l&#39;EGFP. Il est également possible de suivre la morphologie dendritique d&#39;une cellule unique au fil du temps. Sinon, après fixation, exprimant l&#39;EGFP-cellules de Purkinje peut être immunocolorées avec un anticorps anti-GFP. Les deux méthodes peuvent être utilisées pour la coloration des dendrites, les organismes cellulaires et des axones des cellules de Purkinje dans des cultures organotypiques. Parce que le promoteur L7 chez les souris PCP2-EGFP n&#39;est pas exprimé dans toutes les cellules de Purkinje et il ya des variations de la fréquence d&#39;exprimer les cellules de Purkinje entre les souris (Kapfhammer, données non présentées) trancher cultures dérivées de ces souris rendre plus facile à visualiser et mesurer les cellules de Purkinje qui ont des arbres dendritiques qui se chevauchent avec des arbres de Purkinje autres cellules dendritiques. Ces arbres dendritiques peuvent être consultés individuellement les cellules de Purkinje voisines se chevauchent arbres dendritiques ne expriment la GFP (figure 1A, B). </li></ol> 4. Mesure de la cellule de Purkinje dendritiques Taille des arbres et des points de branchement <ol><li> La taille des arbres dendritiques. Avec le marquage fluorescent des cellules de Purkinje la taille de l&#39;arbre dendritique d&#39;une cellule donnée peut être facilement mesurée, si l&#39;arbre n&#39;est pas de chevauchement avec d&#39;autres cellules. Parce que les étiquettes immunomarquage calbindine toutes les cellules de Purkinje, il peut être difficile d&#39;identifier les cellules avec des non-chevauchement des arbres dendritiques. Dans ce cas, l&#39;utilisation de la PCP2-EGFP est recommandé de simplifier l&#39;identification des cellules de Purkinje suffisantes avec des non-chevauchement des arbres dendritiques. Une fois une cellule de Purkinje avec un arbre sans chevauchement dendritique est identifiée, elle est considérée avec l&#39;objectif 20x et une image est enregistrée avec un appareil photo numérique. Cette image peut ensuite être analysées avec un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Nous utilisons Image Pro Plus, qui permet décrivant l&#39;arbre dendritique de la cellule avec un simple clic de souris à l&#39;aide de l&#39;outil baguette magique en mode de mesure (figure 2A). Le programme calcule ensuite la zone couverte par l&#39;arbre dendritique et l&#39;exporte vers MS Excel. L&#39;analyse statistique des données est réalisée avec le logiciel GraphPad Prism (voir ci-dessous). </li><li> Nombre de points de ramification. En raison de la morphologie très ramifié et bien des points de Purkinje dendritiques branches d&#39;arbres cellulaires doivent être comptés manuellement. Le fichier 20x image des cellules de Purkinje est agrandie de sorte qu&#39;il couvre la plupart de l&#39;écran en utilisant Adobe Photoshop. Ensuite, chaque point de ramification est compté et marqué par un vif point (figure 2B). </li></ol> Suivi du développement de l&#39;arbre de Purkinje cellules dendritiques au cours de la période de culture Cultures organotypique dérivés de PCP2-EGFP souris qui expriment l&#39;EGFP spécifiquement dans les cellules de Purkinje permet d&#39;étudier la morphologie des cellules individuelles pendant plusieurs jours en culture. De cette façon, la croissance et le développement de l&#39;arbre dendritique au cours de la période de culture peut très bien être documentées. Vivant identifiés cellules de Purkinje ont été photographiés chaque jour 2 ème ou 3 ème cours de la période de culture avec l&#39;objectif 10x. Cet objectif de faible puissance a été choisi pour éviter et minimiser les dommages phototoxique pour les cellules en raison de l&#39;éclairage avec une lumière fluorescente. Figure 3 montre deux exemples de cellules de Purkinje photographiés dans des cultures vivantes. La première cellule a été suivie à partir de 2 jours in vitro jusqu&#39;à 7 jours in vitro (figure 3, AC). Il est évident que le dendritic arbre de cette cellule au cours de cette période de temps augmente plusieurs nouvelles branches et prend de l&#39;ampleur. Dans le second exemple, une cellule de Purkinje a été suivie de 4 à 11 jours in vitro (figure 3, DF). L&#39;arbre dendritique petit présent à DIV4 étend considérablement au cours de cette période. Ces deux exemples montrent que la plupart de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje présenter à la fin de la période de culture a bel et bien se développer dans la culture. Le développement de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje est inhibée par la PKC ou la stimulation mGluR1 Culture organotypique de tranche de cervelet ont été cultivées pendant 11 jours. À partir de la 2 ème journée in vitro, quelques-uns des cultures ont été traitées soit avec du PMA (50 nM), un ester de phorbol stimuler la PKC ou DHPG (10 uM), un agoniste mGluR1, jusqu&#39;à ce que les cultures ont été fixées. Les deux composés ont été montré précédemment pour empêcher et limiter la croissance de Purkinje cellules dendritiques 7, 8, 9, 5.Dans le témoin non traité tranches de cellules de Purkinje développé un grand arbre typique et très ramifié dendritique qui a été visualisé soit par immunomarquage anti-calbindine (figure 4A) ou dans les cultures avec EGFP exprimant les cellules de Purkinje, par immunomarquage avec des anticorps anti-GFP (figure 4D). Dans les cultures traitées avec du PMA de la morphologie de l&#39;arbre dendritique a été profondément modifié. Les dendrites semblait épaissi et avait seulement quelques courtes branches latérales. De nombreuses cellules de Purkinje, à la différence dans les cultures témoins, n&#39;étaient plus unipolaire, avec un dendrite primaire émanant du corps cellulaire, mais a développé deux ou même plusieurs dendrites primaires (figure 4B, E). Le territoire couvert par l&#39;arbre dendritique a été considérablement réduite (voir ci-dessous). Une situation similaire est présente dans DHPG les cultures traitées. L&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje a été considérablement réduit en taille et la ramification est fortement réduite (figure 4C, F). Cependant, il y avait aussi quelques qualitative différences par rapport aux PMA les cultures traitées. Il n&#39;y avait pas d&#39;épaississement des branches dendritiques, et les dendrites primaires effectué de nombreuses dendrites secondaires très courts (figure 4C, F), suggérant que les événements de signalisation passe au PMA et DHPG traités par les cellules de Purkinje peuvent être similaires, mais pas identiques. Évaluation quantitative de la cellule de Purkinje dendritique taille de l&#39;arbre et les points de branchement pour l&#39;évaluation quantitative, la taille de l&#39;arbre de Purkinje cellules dendritiques et le nombre de points de ramification par cellule de Purkinje est mesurée comme décrit ci-dessus. Résultats d&#39;au moins trois expériences indépendantes sont regroupés, et un minimum de 20 cellules doivent être analysés. La moyenne de la zone couverte par les arbres dendritiques pour les expériences de contrôle est déterminée et fixée à 100%, et les valeurs pour les autres expériences sont exprimés en valeurs de pourcentage en conséquence. L&#39;analyse statistique des données est réalisée avec le logiciel GraphPad Prism. Parce que nous ne sommes passupposer que toutes les valeurs déterminées font partie d&#39;une distribution gaussienne, nous utilisons des tests statistiques qui ne supposent pas une telle distribution des valeurs mesurées. Pour comparer de multiples conditions et les tests de signification statistique, nous utilisons test Kruskal-Wallis suivi d&#39;une procédure appropriée pour les tests post hoc pour le rang de statistiques basées, comme, par exemple, mis en œuvre dans le post-test de Dunn dans GraphPad Prism. Les résultats sont généralement présentés sous forme de graphiques à barres. Un exemple d&#39;une telle évaluation statistique est donnée à la figure 5. Tant l&#39;analyse de la taille de l&#39;arbre dendritique (figure 5A) et le nombre de points de branchement par des cellules de Purkinje (figure 5B) montrent des différences claires entre la condition contrôle et le traitement DHPG ou PMA. Ces deux paramètres sont différents avec une signification statistique de p &lt;0,001 selon le test de Kruskal-Wallis. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figure 1. EGFP-marqué cellule de Purkinje. En PCP2-EGFP souris ne sont pas toutes les cellules de Purkinje expresse EGFP. Par conséquent, les arbres dendritiques des cellules de Purkinje certains peuvent être consultés individuellement quand ils expriment l&#39;EGFP (EGFP canal A) et les cellules de Purkinje voisines se chevauchent arbres dendritiques ne sont pas (négatif dans le canal EGFP montré en A, positif dans la coloration anti-calbindine montré dans le canal rouge en B). Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Figure 2. Mesure des paramètres dendritiques des cellules de Purkinje. (A). La taille de l&#39;arbre dendritique peut être facilement mesurée en traçant le contour de la cellule de Purkinje avec un simple clic de souris dans le Image Pro analyse d&#39;images ainsi que le logiciel en utilisant l&#39;outil baguette magique. L&#39;outil Baguette magique est utilisé de telle sorte que l&#39;arbre dendritique entier, y compris le corps cellulaire et toutes les branches dendritiques sont complètement encerclée par la ligne. (B). Le nombre de points de branchement est counted manuellement dans les images des cellules de Purkinje. Chaque point de dérivation est marqué d&#39;un point jaune. Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Figure 3. Suivre l&#39;évolution de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje. Identifiés cellules de Purkinje ont été photographiés à plusieurs reprises pour suivre la croissance de l&#39;arbre dendritique. (AC): arbre dendritique d&#39;une cellule de Purkinje croissance et le développement au jour in vitro (DIV) 2 jusqu&#39;à ce que DIV7. Il ya une croissance continue et la ramification des dendrites au cours de cette période de culture. (DF): arbre dendritique d&#39;une cellule de Purkinje croissance et le développement de DIV4 jusqu&#39;à DIV11. L&#39;arbre dendritique augmente considérablement au cours de cette période de culture. Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Figure 4. Le développement de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje est inhibée par la PKC ou mGluR1 stimulatià (A), (D):. cellules témoins non traitées avec un arbre dendritique bien développé. (B), (E): Après 9 jours de traitement dendrites PMA semblent épaissies et l&#39;arbre dendritique est fortement réduite en taille. Les cellules perdent souvent leur polarisation et de devenir bipolaire (E). (C), (F): Après 9 jours de traitement DHPG l&#39;arbre dendritique est fortement réduite en taille. Contrairement au traitement du PMA, de nombreuses branches latérales très fines et courtes sont présentes sur les dendrites primaires et secondaires. Les cellules perdent souvent leur polarisation et de devenir bipolaire (F). Cellules de Purkinje ont été visualisées par immunocoloration anti-calbindine en (A - C) et par EGFP-expression dans les cultures dérivées de PCP2-EGFP dans des souris (D - F). Barre d&#39;échelle = 50 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;évaluation quantitative des cellules de Purkinje dendritique taille des arbres et la ramification. Mesures quantitatives montrent que la taille arbre dendritique (graphique à barres en haut) et la number de points de branchement (indicateur du bas) sont fortement réduites après traitement au PMA ou DHPG. Les différences entre les arbres dendritiques de contrôle et d&#39;arbres dendritiques des cellules de Purkinje de cultures traitées sont significatives avec p &lt;0,001.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la Directive européenne du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses. Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les méthodes présentées ici permettent d&#39;étudier le développement de cellules dendritiques Purkinje en culture organotypique de tranche de cervelet et d&#39;évaluer quantitativement l&#39;expansion Purkinje cellules dendritiques en mesurant la dimension des arbres dendritique et le nombre de points de ramification dendritique. Bien sûr, une analyse plus approfondie et quantitatif sophistiqué des dendrites des cellules de Purkinje est possible, par exemple en déterminant la longueur totale dendritique, effec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Inserts de culture de tissus </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Les PICMORG50 inserts ont une jante basse et permettre la visualisation des cultures vivantes au microscope </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basale Medum Aigle </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-dihydroxy-phénylglycine (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-calbindine D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, clone A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Cellules de Purkinje sont un système modèle intéressant pour l&#39;étude du développement dendritique, parce qu&#39;ils ont un arbre dendritique impressionnante qui est strictement orienté dans le plan sagittal et se développe surtout dans la période post-natale chez les petits rongeurs 3. En outre, plusieurs anticorps qui sont disponibles marquer les cellules de Purkinje sélective et intensive, y compris tous les processus, avec des anti-calbindine D28K étant le plus largement utilisé. Pour l&#39;affichage de dendrites dans les cellules vivantes, des souris exprimant l&#39;EGFP de manière sélective dans les cellules de Purkinje 11 sont disponibles auprès des laboratoires Jackson. Organotypiques cérébelleuse cultures tranche cellules permettent facilement manipulation expérimentale du développement de Purkinje cellules dendritiques parce que la plupart de l&#39;expansion de l&#39;arbre dendritique Purkinje cellules dendritiques qui se passe réellement pendant la période de culture 4. Nous présentons ici un bref protocole fiable et facile pour la visualisation et l&#39;analyse de la morphologie dendritique des cellules de Purkinje cultivé dans organotypic cultures tranche de cervelet. Pour de nombreuses raisons, une évaluation quantitative de l&#39;arbre de Purkinje cellules dendritiques est souhaitable. Nous nous concentrons ici sur deux paramètres, la taille des arbres dendritiques et les numéros de point de branchement, qui peuvent être rapidement et facilement déterminées à partir anti-calbindine tachées cultures tranche de cervelet. Ces deux paramètres donnent une mesure fiable et sensible des variations de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje. En utilisant l&#39;exemple des traitements avec la protéine kinase C PMA (PKC) et l&#39;activateur de récepteurs métabotropiques du glutamate 1 (mGluR1), nous montrons comment les différences dans le développement dendritique sont visualisés et évalués quantitativement. La combinaison de la présence d&#39;un arbre dendritique étendues, les méthodes sélectives et immunomarquage intense, aux cultures organotypiques de tranches qui couvrent la période de croissance dendritique et d&#39;un modèle de souris avec des cellules de Purkinje EGFP expression spécifique des cellules de Purkinje faire un modèle de système puissant pour révéler les mécanismes de dendritique développement.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Nous présentons un protocole qui permet de visualiser et d&#39;évaluer quantitativement la morphologie de l&#39;arbre dendritique des cellules de Purkinje individuelles cultivées en culture organotypique de tranche de cervelet. Ce protocole a pour but de promouvoir les études sur les mécanismes de développement de Purkinje cellules dendritiques.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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18.4K vues.  University of Basel. Nous présentons un protocole qui permet de visualiser et d'évaluer quantitativement la morphologie de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje individuelles cultivées en culture organotypique de tranche de cervelet. Ce protocole a pour but de promouvoir les études sur les mécanismes de développement de Purkinje cellules dendritiques.

Vidéo: The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Analyse automatisée des Sholl morphologie neuronale numérisés à de multiples échelles

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Mise en place pour l&#39;investigation détaillée des interactions Neuron-glie