Nous tenons à remercier Emeka Ifedigbo d&#39;assistance technique et le Dr Shivraj Tyagi d&#39;expertise précieuse. Nous remercions également le Centre NeuroDiscovery Harvard pour l&#39;assistance à la microscopie. Ce travail a été soutenu en partie par une American Heart Association prédoctorale octroi d&#39;09PRE2250120 Hilaire Lam, et des subventions des NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, décerné à AMK Choi.

Le protocole global nécessite 2 jours pour des isolations de cellules d&#39;un tissu animal, 5-10 jours pour la prolifération cellulaire, et une de 10 à 14 jours supplémentaires pour la différenciation cellulaire à l&#39;interface air-liquide. Une journée supplémentaire est nécessaire pour les expositions de cellules et de récolte des échantillons. 1. Isolement des souris trachéobronchique cellules épithéliales (MTEC). Note: Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été examinés et approuvés par les soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisez au Brigham and Women &#39;s Hospital / Harvard Medical School Area. Avant de commencer: <ul><li> Préparer F12 de Ham médias contenant des antibiotiques. Pour 250 ml de Ham F12 milieux de base (Cellgro) ajouter 2,50 ml d&#39;une pénicilline 100 X / streptomycine (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) solution et 250 ul d&#39;une solution X 1000 Fungizone. Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines au maximum. </li><li> Préparer une solution de pronase 0,15%. Ajouter 15 mg pronase à 10 mL de Ham F12 médias contenant des antibiotiques. Faire frais et les garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer une surface de travail propre et stérile des instruments chirurgicaux appropriés pour la chirurgie des petits animaux, et d&#39;une hotte tissu lamellaire culture pour isolement cellulaire. Tous les autres équipements est considéré comme standard pour la culture de cellules animales, y compris humidifié CO 2 incubateurs, chambre froide, cellule de table centrifugeuses, microscope inversé, et jetables de pipette en plastique et ustensiles de la culture. </li><li> Préparer une solution de collagène I (50 pg / mL dans 0,02 N d&#39;acide acétique). Pipeter 1,0 ml solution de collagène dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits transwell (Corning). Envelopper dans du parafilm et laisser reposer une nuit sur une surface plane à la température ambiante. </li></ul><ol><li> En utilisant une souche de souris disponibles dans le commerce (c&#39;est à dire, C57BL / 6, mâle 6-8 semaines), euthanasier des souris en utilisant une méthode approuvée de l&#39;euthanasie comme le CO 2 induit une narcose. Typiquement 6 souris donnera suffisamment de cellules (1,5-2,0 x 10 5 cellules / souris) aux semences d&#39;une plaque de 12 puits transwell. </li><li> Vaporiser les carcasses des animaux avec une solution EtOH à 70% pour stériliser le terrain. </li><li> Avec propres ciseaux chirurgicaux et de scalpel, enlever la peau autour de la zone trachéale, et d&#39;exposer la trachée. Ouvrez l&#39;abdomen, couper le long du sternum, et enlever la cage thoracique. Retirez le tissu jusqu&#39;à la fin de la trachée est exposée. </li><li> Trachées Placer dans un tube conique de 50 ml contenant 30 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques, sur la glace. </li><li> Dans une hotte à flux lamellaire stérile, le transfert de tissu trachéal dans un plat stériles 100 mm de Pétri contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques. </li><li> Doucement disséquer le tissu conjonctif avec des pinces stériles et des ciseaux chirurgicaux. </li><li> Transfert tissu trachéal à un nouveau plat de 100 mm de Pétri contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant des antibiotiques pour se rincer. Couper le long des trachées axe vertical à exposer lumen. </li><li> Transfert trachées d&#39;un tube de 50 ml contenant 10 ml de solution pronase 0,15% et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le deuxième jour, avoir en main: <ul><li> Préparer une solution de DNase I. À 18 ml de F12 de Ham médias contenant des antibiotiques ajouter 2 mL de 10 mg / ml solution de sérum bovin stock de l&#39;albumine (BSA), et 10 mg de brut du pancréas DNAse I. Faire aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C (décongelées sur la glace avant utilisation). </li><li> Préparer F12 de Ham support contenant des antibiotiques avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). Pour 200 ml de Ham F12 milieux de base (Invitrogen) ajouter 50 ml de FBS inactivé de la chaleur, 2,5 mL d&#39;une pénicilline 100 X / streptomycine (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) solution, et 250 ul d&#39;une solution X 1000 Fungizone . </li><li> Préparer MTEC milieu de base contenant des antibiotiques. Pour 475,5 mL DMEM/F12 multimédia de base (Cellgro) ajouter 7,5 mL 1 M HEPES solution, 10 ml de solution de 200 mM de glutamine, 2 ml d&#39;un 7,5% NaHCO 3, 5 mL d&#39;une pénicilline 100 X / solution de streptomycine, 500 ul d&#39;une solution X 1000 Fungizone </li><li> Préparer FBS MTEC% medium/10. Pour 45 ml d&#39;MTEC milieu basique contenant des antibiotiques, ajoutez 5 ml de FBS inactivé de la chaleur. </li></ul></li><li> Secouez doucement le tube (de l&#39;étape 1.8) 10-12 fois, puis laissez-le reposer pendant 30-60 minutes à 4 ° C. </li><li> Ajouter 10 ml de Ham F12 supports contenant 20% de FBS et des antibiotiques pour le tube et le rock 12 fois. </li><li> Préparer 3 tubes coniques 15 ml contenant 10 ml de Ham F12 supports contenant 20% de FBS et des antibiotiques. </li><li> Retirer trachées de la solution pronase, mettant de côté cette solution sur la glace. Transfert trachées au tube conique première contenant F12 de Ham et inverser le tube 12 fois. Répétez ce processus deux fois plus. </li><li> Combinez solution de pronase avec les trois surnageants de l&#39;étape 1.13 en un seul tube de 50 ml. Jeter les tissus restants. </li><li> Centrifuger à 1400tr/min (390 xg; Eppendorf 5810R centrifugeuse équipée d&#39;un rotor A-4-62) pendant 10 min à 4 ° C, et éliminer le surnageant. </li><li> Doucement Reprendre le culot dans 1 ml de solution de DNAse (100-200 ul / trachée)et incuber 5 min sur la glace. </li><li> Centrifuger à 1400tr/min (390 xg) pendant 5 min à 4 ° C, et éliminer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 8 ml MTEC milieu contenant 10% de FBS </li><li> Suspension cellulaire plaque sur plaques Primaria (Falcon). Incuber à 37 ° C dans une atmosphère d&#39;air de 95%, 5% de CO 2 pendant 5 heures (Note: ceci est une étape de sélection négative pour les fibroblastes). </li><li> Recueillir la suspension cellulaire à partir de plaques et rincer les plaques à deux reprises avec 4 ml MTEC contenant 10% de FBS. Suspension cellulaire piscine et les lave-ensemble dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Conserver 1 mL pour cytospin et le comptage des cellules. De spin dans une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Retirer 500 pl et resuspendre le culot dans le surnageant restant. Utiliser 100 uL pour le comptage des cellules en utilisant la méthode coloration au bleu trypan vitale. Conserver 4 aliquots de 100 ul d&#39;analyse cytospin </li><li> Spin reste, soit 15 ml de suspension cellulaire à 1400tr/min (390 xg), à 4 ° C pendant 10 min. </li></ol> 2. Multiplication et différenciation des MTEC Au interface air-liquide Préparer rétinoïque solutions stock d&#39;acide. Une solution stock: Peser l&#39;acide rétinoïque dans le noir (M. 300,44 g / mol) pour faire une solution à 5 mM dans EtOH 95%. Conserver dans un tube de papier d&#39;emballage à -80 ° C. Au besoin, préparer la solution stock B (5 uM) en ajoutant 50 uL Stock A, 500 uL solution de BSA (100 mg / ml) et 49,5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Stocker dans une feuille enroulée du tube à -80 ° C pendant 4 semaines au maximum. Préparer milieu de prolifération MTEC contenant l&#39;acide rétinoïque. Pour 45,7 mL médias MTEC basale contenant des antibiotiques, ajouter inactivés par la chaleur de 2,5 mL de FBS, 1 ml d&#39;acide rétinoïque Stock B, 250 uL solution d&#39;insuline (2 mg / mL d&#39;insuline dans 4 mM HCl), 250 uL solution de facteur de croissance épidermique (5 pg / ml EGF dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA), 200 ul d&#39;extrait pituitaire bovin (15 mg / mL dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA), une solution à 50 uL de la transferrine (5 mg / ml de transferrine dans HBS contenant 1 mg / ml de BSA ), solution à 50 uL toxine cholérique (100 mg / mL dans HBS contenant 1 mg / ml BSA). Stériliser par filtration finale la préparation des milieux et l&#39;utilisation dans les 2 jours de préparation. <ol><li> Retirer solution de collagène à partir de plaques transwell, laisser reposer sous le capot pendant 5 min, et laver avec du PBS deux fois. </li><li> Après la centrifugation, resuspendre le culot cellulaire dans un volume approprié de la prolifération des médias (500 pl) pour faciliter le placage de 7,5 x 10 4 -1,0 x10 5 cellules par puits. Pipeter 500 uL suspension cellulaire sur la surface apicale de l&#39;insert transwell membrane en polycarbonate. Ajouter 1,5 mL de la prolifération des médias dans le compartiment basal de la transwell. </li><li> Incuber les cultures MTEC submergée à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 95% d&#39;air, 5% de CO 2 pour les 7-10 jours. </li><li> Attendre trois jours avant de changer de média pour la première fois. Changer les médias tous les jours. Surveiller les cultures par une inspection visuelle et la mesure de résistance de la cellule en utilisant une électrode transépithélial (EVOM Ohmvoltometer, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride). </li><li> Lorsque les cellules confluentes apparaissent et la résistance épithéliale atteint 1000 Ω / cm 2, les cellules sont prêtes à se différencier à Ali. </li><li> Préparer MTEC milieux de base contenant NuSerum 2%. Ajouter au NuSerum MTEC milieu basique à une concentration finale de 2% V / V. Ajouter rétinoïque B Stock acide à une concentration finale de 1 x 10 -7 M avant d&#39;utiliser. Préparer une solution fraîche et utiliser dans les 2 jours. </li><li> Laissez la cellule de différencier pendant 10-14 jours, en supprimant les médias apicale et le remplacement des milieux de base avec 750 uL MTEC milieux de base contenant 2% d&#39;acide rétinoïque et Nuserum. Changer les médias basale et laver le côté apical avec MTEC contenant NuSerum 2% tous les autres jours. </li></ol> 3. Application de fumée de cigarette à des cultures de cellules épithéliales <ol><li> Exposer la partie apicale des cultures transwell à la fumée de cigarette dominante en utilisant un système d&#39;exposition au CS cellule (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Voir la Figure 1 pour une photographie de l&#39;appareil. Voir le tableau des réactifs et équipements spécifiques pour les spécifications techniques. En bref, l&#39;appareil est constitué d&#39;une pompe péristaltique qui fume chaque cigarette en ~ 7-8 bouffées, dessin dans la fumée principale dans une ligne de polypropylène qui est relié à une chambre d&#39;exposition ventilé. La chambre d&#39;exposition est maintenue à 37 ° C par circulation d&#39;eau, et maintenue à une atmosphère de 5% de CO 2 sur une ligne de gaz. Les cellules peuvent être exposés à la fumée à l&#39;aide du Kentucky 3R4F de recherche de référence cigarettes à bout filtre (Le tabac Research Institute, Université du Kentucky, Lexington, KY). Généralement les cellules sont exposées à la fumée de 1 à 2 cigarettes, ce qui donne 100-200 mg / m 3 de matières particulaires totales (MPT). Contrôle des cultures sont exposées à l&#39;air ambiant pendant une période d&#39;exposition équivalente. </li><li> Le TPM est mesurée selon le protocole du fabricant fournies avec le TE-10c machine à fumer (Entreprises Teague). En bref, un filtre (Pallflex) est placé dans un support en acier inoxydable en ligne sur un tuyau de prélèvement débouchant à partir du port d&#39;échantillonnage sur la chambre de fumage à une pompe à débit constant (unité d&#39;échantillonnage). Un tube de sortie se connecte l&#39;unité d&#39;échantillonnage à un compteur de gaz (compteur de gaz sec, ONM61, 67, AEM). Le filtre est pesé avant et après le prélèvement du gaz. Le matériel total déposé sur le filtre en mg est normalisée pour le volume total d&#39;air échantillonné. </li><li> Les cellules peuvent ensuite être récoltées à n&#39;importe quel point dans le temps (ie, 0-24 heures) après l&#39;exposition pour les procédures analytiques standard cellulaire (c&#39;est à dire, Western immunoblot, analyse d&#39;ARNm, etc) ou la microscopie (ie, la microscopie confocale ou électronique). Les milieux de culture peuvent également être analysés pour des cytokines ou la libération de LDH pour les tests de cytotoxicité. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le succès d&#39;isolement épithéliales, la prolifération et la différenciation à ALI devrait donner une monocouche intacte avec une morphologie pavées. Résistance de la cellule Transepithelilal des cultures saines devrait être d&#39;environ 1000-2000 Ω / cm 2. La figure 2 illustre une monocouche de cellules épithéliales respiratoires de souris colorées pour cellules épithéliales et les cils marqueurs dans des conditions de contrôle et après l&#39;exposition de fumée de cigarettes. La figure 3 montre microscope électronique représentant de saines cultures MTEC, dépeignant ultrastructure et la morphologie des cils. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Préparation du produit de cellules épithéliales par trois phases, une étape d&#39;isolement, une étape de propagation, et un stade de différenciation à l&#39;interface air-liquide (schéma). Les cellules épithéliales sont isolées de la souris trachée, ensemencées sur transwells où elles prolifèrent en culture immergée, puis convertie en interface air-liquide où ils totalement différencier. Les expériences sont généralement menées sur le 24 e jour de culture continue. L&#39;image représente un système modèle pour l&#39;exposition de cellules cultivées à la fumée de cigarette traditionnelle. Un système de culture transwell ALI est placé à l&#39;intérieur d&#39;un système personnalisé de cigarettes fumées modulaire de livraison qui est contrôlée par la température, l&#39;humidité et de CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 cultures de cellules épithéliales ont été fixées et colorées pour les noyaux (Hoechst 33258), F-actine (vert; Alexa Fluor-488-phalloïdine conjuguée). Et le marqueur de cils acétylés α-tubuline (en rouge; Cy3 anticorps secondaire conjugué). Les panneaux inférieurs montrent des images équivalentes des cellules épithéliales pris 4 heures après l&#39;exposition à la fumée de cigarette (2 cigarettes, 150 mg / m 3). (B) lactate déshydrogénase (LDH) libération a été mesurée dans le milieu de base 24 heures après l&#39;exposition à des doses variables de la fumée de cigarette, comme indiqué. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Cultures interface air-liquide des cellules épithéliales isolées de l&#39;épithélium trachéal de souris différencier dans plusieurs sous-types que par microscopie électronique à transmission (MET) ont les caractéristiques d&#39;ciliées, des cellules basales, et non ciliées 1. Ces cellules sont typiques pseudo-épithélium respiratoire. Figure étiquettes correspondent à: bb: basale du corps, un: axonème, m: mitochondries, n: le noyau, s: substrat (membrane en polycarbonate), mv: microvili

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Le protocole décrit l&#39;isolement de la souris des cellules épithéliales trachéales est adaptée à partir des protocoles de You et coll., 1, et d&#39;autres 2-3 avec des modifications. Comme avec n&#39;importe quelle cellule isolements protocole décrivant l&#39;aspect le plus essentiel est d&#39;éviter la contamination par des pathogènes bactériens ou fongiques en utilisant des techniques aseptiques strictes. Une seconde étape essentielle est d&#39;éviter la contamination des ...

* La machine à fumer la cigarette est une coutume conçu et fabriqué 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;double chambre et de l&#39;eau une preuve enveloppe légère teinte claire 1 / 2&quot; d&#39;épaisseur polycarbonate Lexan chambre pour exposition à la fumée de cigarette à température contrôlée, capteur de niveau d&#39;eau contrôlé éteint le système. Une cigarette fumer / soufflant appareil est installé pour une cigarette variables soufflant taux. Lorsque l&#39;appareil est utilisé, il imite un incubateur dans le sens que la température, l&#39;humidité et le dioxyde de carbone sont contrôlés dans le système. Le système comprend: (i) une mesure double chambre / unité d&#39;eau double enveloppe qui maintient un environnement contrôlé pour des expériences de culture de tissus. (Ii) le devoir numériques lourdes, de haute précision de l&#39;eau à double circulateur la température du système avec capteur de niveau d&#39;eau et contrôle de la température (III) Une unité de la cigarette et soufflant pompe. (Iv) un cycle de capteur de la pompe de contrôle de débit cycleur (IV) Une précision en acier inoxydable en ligne haute porte-filtre. (V) Un couvercle amovible monté 11 / 2 &quot;taille de ventilateur axial de la fumée de cigarette d&#39;uniformité de mélange. (VI) Un bain d&#39;eau de taille moyenne avec support de montage pour la circulation d&#39;eau. (Vii) une 1 / 2 &#39;Bac épaisse en plexiglas avec des supports pour la Pompe feuilletée et support pour collecteur de cendres de cigarette. Cette machine comme décrit peut être remplacé par des machines similaires fumer commercialement disponibles tels que le type disponibles à partir de systèmes d&#39;EST ( <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide (ALI) comme un modèle de l&#39;épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour isoler et exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante (CS), afin d&#39;étudier les réponses des cellules épithéliales de l&#39;exposition CS. Le protocole se compose de trois parties: l&#39;isolement des cellules épithéliales des voies aériennes de la souris la trachée, la culture de ces cellules à l&#39;interface air-liquide (ALI) comme complètement différenciées des cellules épithéliales, et la livraison de courant calibrée CS à ces cellules en culture. Le système de culture permet ALI la culture de l&#39;épithélium respiratoire dans des conditions qui ressemblent davantage à leur environnement physiologique que les systèmes ordinaires de culture liquide. L&#39;étude de la biologie moléculaire et du poumon réponses cellulaires à l&#39;exposition CS est un élément essentiel de comprendre l&#39;impact de la pollution de l&#39;air ambiant sur la santé humaine. Les résultats des recherches dans ce domaine peuvent finalement contribuer à la compréhension de l&#39;étiologie de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), et d&#39;autres maladies liées au tabac, qui représentent d&#39;importants problèmes de santé mondiaux.

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide comme un modèle de l&#39;épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour l&#39;isolement, la culture et d&#39;exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante, afin d&#39;étudier les réponses moléculaires à cette toxine de l&#39;environnement.

L&#39;isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l&#39;exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

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Medicine

33.8K vues.  Harvard Medical School. Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide comme un modèle de l'épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour l'isolement, la culture et d'exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante, afin d'étudier les réponses moléculaires à cette toxine de l'environnement.

Vidéo: Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Expérimentale transport pneumocoque humaines

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Recherche

Médecine

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Mesure automatisée de l&#39;emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

Comparer les effets de la vapeur de cigarette électronique et de la fumée de cigarette dans un roman<em&gt; In vivo</em&gt; Système d&#39;exposition

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Évaluation de la toxicité par inhalation aigue des particules aéroportées en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’interface air-liquide

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Effet des formulations de larmes artificielles sur l’activité métabolique des cellules épithéliales cornéennes humaines après exposition à la dessiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.