Nous tenons à remercier le Dr Bill Cashdollar pour son soutien dans l&#39;utilisation de la cytométrie de flux de base.

<ol><li> Avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être recueillis et préparés à: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Glace </li><li> 15 ml tubes coniques pour les cellules de coloration et de 12 x 75 mm pour les tubes d&#39;écoulement coloration contrôles de couleur unique. </li><li> Coloration tampon: tampon phosphate salin (PBS) + 3% sérum de veau foetal (FCS) </li><li> Pipettes </li><li> Fc bloc (si nécessaire) et d&#39;anticorps coloration. Anticorps besoin d&#39;être titré pour la coloration optimale. </li><li> Indemnisation des perles </li><li> Suspension de tampon: Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% de FCS </li><li> Bleu Trypan et hémocytomètre </li><li> Cellule crépine (40 um Nylon) </li><li> Tubes de prélèvement: Deux types de tubes de prélèvement peut être utilisé a) 12 x 75 mm tubes en polystyrène (contenant 300 ul de FCS et 25 mM d&#39;HEPES) ou b) tubes de 15 ml conique (contenant 1 ml de FCS + 25 mM HEPES). Toute milieu riche avec une concentration sérique élevé peut être utilisé pour la collecte de cellules triées. </li></ol></li><li> Générer une suspension cellulaire unique de la population de cellules de départ. </li><li> En option: Enrichir pour la population de cellules désirée par un procédé de purification en vrac telles que l&#39;appauvrissement de compléter ou de tri magnétique. Le principal avantage de l&#39;étape d&#39;enrichissement est que cela réduit le temps de trier. </li><li> Laver les cellules une fois avec coloration tampon. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans la coloration de tampon à une concentration allant jusqu&#39;à 50 x 10 6 pour la coloration efficace. </li><li> Facultatif: Pour les cellules exprimant des niveaux élevés de FcR, bloquer les récepteurs utilisant une méthode appropriée de blocage. Une méthode de choix est l&#39;utilisation d&#39;un anticorps monoclonal qui se lie à FcyR sur la glace pendant 10-15 min. Ces anticorps sont disponibles commercialement. </li><li> Ajouter le mAb appropriés (à une concentration prédéterminée) pour colorer la population de cellules désirée et incuber pendant 20-30 min sur la glace dans l&#39;obscurité, suivie de deux lavages avec le tampon de coloration. En option: coloration avec un colorant vital, comme l&#39;iodure de propidium, peuvent être inclus à discerner les cellules mortes (5). Si multi-couleurs coloration doit être utilisée, les contrôles sont nécessaires seule couleur. Nous utilisons CompBeads BD pour préparer les contrôles seule couleur en utilisant le protocole du fabricant. </li><li> Si ce n&#39;est pas l&#39;aide d&#39;anticorps directement conjugués, répétez l&#39;étape 7, en utilisant l&#39;anticorps secondaire approprié ou conjugué streptavidine. </li><li> Après le lavage, remettre les cellules en milieu de culture et de déterminer la concentration de cellules en utilisant un colorant vital comme le bleu trypan. </li><li> Ajuster la concentration de cellules à 15-20 x 10 6 / ml. Pour les populations de cellules qui forment des grappes, qui peut obstruer l&#39;instrument pendant le tri, le filtrage des cellules à travers une passoire. </li><li> Mettre en place et optimiser le trieur de cellules. Le processus de mise en place d&#39;un cytomètre en flux est varié en fonction de la fabrication et doit être effectuée par un personnel correctement formé. Les recommandations générales sont les suivantes: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Sélectionner la buse appropriée selon le type de cellules à trier. </li><li> Pour sortes stérile, stériliser les instruments. </li><li> Effectuer le contrôle qualité des instruments avec des perles de vérifier les lasers sont fonctionnement, et il est le tri de précision. </li><li> Installer le dispositif de collecte nécessaires et mettre en place les flux secondaires. </li><li> Regardez au laser de l&#39;instrument et le détecteur mis en place pour déterminer les marqueurs fluorescents qui peuvent être utilisés (notre BD FACS Aria a trois lasers et peut détecter jusqu&#39;à neuf couleurs). </li><li> Dès qu&#39;il est déterminé ce que les étiquettes fluorescentes sera utilisé sur le trieur de cellules, la compensation peut être effectuée (comme expliqué ci-dessous). </li></ol></li><li> Effectuer une indemnisation en utilisant l&#39;échantillon de contrôle négatif et le contrôle positif unique. La rémunération est nécessaire de supprimer le chevauchement du spectre entre deux détecteurs. Il est pertinent de noter que la rémunération n&#39;est pas une panacée et elle est affectée par la manière dont certains marqueurs brillamment tache, et par la fluorescence des cellules qui ont autofluorescence faible, ce qui peut conduire à une faible résolution entre populations faible et négative. Pour de meilleurs résultats, le modèle expérimental devrait inclure l&#39;aide fluorochromes lumineux avec des marqueurs qui ont une expression faible ou qui n&#39;ont pas un motif de coloration connues. Marqueurs qui fournissent une bonne séparation entre les populations de cellules et sont fortement exprimés doivent être utilisés avec des fluorochromes dimère comme ceux excités par des lasers rouges ou violettes. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> La compensation peut être réalisée avec des perles de compensation, qui sont des microparticules de polystyrène qui ont été couplées à un anticorps spécifique de la chaîne légère kappa des Ig de souris, le rat ou rat / hamster. Les perles sont faciles à colorer, avoir un signal robuste et offrent un moyen facile de préparer seul contrôle qui ont teinté le fluorophore même que les échantillons expérimentaux. </li><li> Mettre en place un modèle qui comprend un graphe bivarié à afficher diffusion vers l&#39;avant (FSC) et diffusion latérale (SSC), et un histogramme pourchaque fluorochrome qui sera utilisé. </li><li> Exécutez le tube de contrôle négatif et ajuster la diffusion vers l&#39;avant (FSC) et diffusion latérale (SSC) pour placer la population d&#39;intérêt sur la balance. </li><li> Ajustez les paramètres de fluorescence PMT à placer la population négatif ou autofluorescence dans la partie extrême gauche de l&#39;histogramme. </li><li> Enregistrez le tube de contrôle négatif. </li><li> Exécuter les tubes simples de contrôle positif et d&#39;enregistrer les données de chaque tube. </li><li> Dessinez une porte intervalle autour de la partie positive des données sur l&#39;histogramme, et une autre porte d&#39;intervalle sur la partie négative de l&#39;histogramme. </li><li> Compensation manuelle se fait en ajustant la valeur médiane (médiane est une meilleure estimation de la tendance centrale que la moyenne sur une échelle logarithmique) des points positifs jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit égale à la médiane des négatifs. Cela doit être fait pour chacune des étiquettes fluorochrome utilisé dans l&#39;expérience. </li><li> Pour ajuster la valeur médiane, ajustez les valeurs spectrales de chevauchement soit supérieure ou inférieure jusqu&#39;à ce que la médiane pour chaque match de paramètres fluorescentes aussi étroitement que possible. </li><li> L&#39;indemnisation peut également être fait automatiquement avec le logiciel d&#39;analyse. La compensation automatique utilise les données enregistrées à partir des contrôles de compensation pour calculer une matrice algébrique pour tous les fluorophores utilisés dans l&#39;expérience. Ces valeurs sont utilisées pour soustraire la contribution des non-couleurs primaires qui sont des saignements dans une couleur détecteur de primaire. </li></ol></li><li> Enregistrement de l&#39;échantillon expérimental pour être triés et utiliser des outils et des méthodes de déclenchement de sous-ensembles pour définir les populations d&#39;intérêt. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Mettre en place le modèle expérimental avec un dot plot qui affiche FSC vs SSC et l&#39;utilisation d&#39;un outil de déclenchement, polygone, rectangle, intervalle ou quadrant de la porte de la population d&#39;intérêt. Le nuage de points affiche les propriétés physiques de la cellule qui est distinct du type cellulaire. </li><li> La meilleure façon de déterminer la stratégie de gating fluorescence est d&#39;utiliser la fluorescence moins un (FMO) contrôles. Dans un tube de contrôle FMO tous les réactifs qui sont utilisés dans l&#39;expérience sont inclus, sauf pour l&#39;un des intérêts. La FMO permet une discrimination entre les populations faiblement colorés et larges populations négatives. </li><li> Utiliser les données enregistrées à partir des tubes à FMO déterminer où placer les portes dans le tube expérimental. </li></ol></li><li> Une fois les portes ont été déterminés, les portes peuvent être sélectionnés pour le tri dans les tubes de prélèvement externe. Jusqu&#39;à quatre portes (ou populations) peuvent être triées en une seule fois en fonction de l&#39;instrumentation disponible. </li><li> Exécutez le tube échantillon expérimental à 4 ° C, tournez sur des plaques de déviation, et de trier l&#39;échantillon. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 cellules peuvent être triés dans un tube de 12 x 75 mm et 1,5 x 10 6 - 4,5 x 10 6 cellules peuvent être triés dans un cône de 15 ml. </li><li> Une fois le nombre requis de cellules a été obtenue, arrêter manuellement le tri. </li><li> Effectuer une analyse post-tri pour déterminer la pureté des populations de cellules triées. </li></ol> Les résultats représentatifs Nous avons montré ici les résultats pour B spléniques de souris et de tri de lymphocytes T CD4 (figure 1). Les splénocytes ont été colorés avec du PE Texas Red-conjugué anti-souris B220, conjuguée au FITC anti-souris et les TCRβ AlexaFluor-700-anti-souris conjugué CD4 pour identifier les cellules B (B220 + TCRβ-) et les cellules T CD4 (CD4 + TCRβ + ). Le tri a été effectué avec BD FACS Aria instrument. Après le tri de la pureté des cellules B est&gt; 97% et la pureté des cellules T CD4 est&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pureté des cellules B spléniques et lymphocytes T CD4 après FACS. Splénocytes de souris ont été colorés avec anti-souris B220, et les anticorps CD4 TCRβ. FACS des cellules B a été effectuée en utilisant une BD FACS Aria par gating sur le B220 + TCRβ-cellules (Fig. 1A, volet de gauche, quadrant inférieur droit). Une analyse tri message a été effectuée pour déterminer la pureté des cellules B (figure 1A, le panneau de droite). Coloration B220 est indiqué sur l&#39;axe des x et la coloration TCRβ sur l&#39;axe des ordonnées. FACS des cellules T CD4 a été réalisée en utilisant le cytomètre de flux par les mêmes gating sur TCRβ + CD4 + (figure 1B, panneau de gauche, quadrant supérieur droit). Une analyse de tri poste a été effectuée pour déterminer la pureté des cellules T CD4 (Fig. 1B, panneau de droite). Coloration TCRβ est indiqué sur l&#39;axe des x et CD4 taches sur l&#39;axe des y. Les cellules positives pour cent dans chaque quadrant est montré. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Pureté de CD4 des lymphocytes T spléniques après FACS. Murins cellules T spléniques ont été enrichies par l&#39;élimination des cellules B par le panoramique. Par la suite, les cellules ont été colorées avec anti-souris et les TCRβ anticorps CD4 (panneau de gauche). FACS a été effectuée en utilisant une BD FACS Aria par gating sur TCRβ + CD4 + (panneau de gauche, en haut à droite quadrant). Une analyse tri message a été effectuée pour déterminer la pureté des cellules T, qui a été supérieure à 99% (à droite). Coloration TCRβ est indiqué sur l&#39;axe des x et CD4 taches sur l&#39;axe des y. Les cellules positives pour cent dans chaque quadrant est montré. -&gt;

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FACS est une technique très sophistiquée de purification des populations de cellules d&#39;intérêt, dans laquelle une très grande pureté (95-100%) de la population triés peuvent être obtenues. Par conséquent, cette technique est particulièrement important pour des expériences, où une grande pureté est une exigence essentielle (par exemple l&#39;analyse des microréseaux). FACS est particulièrement avantageux par rapport aux autres méthodes disponibles de purification où une population de cellules doit être purifié basé sur un marqueur de surface exprimées par semaine ou lorsque deux ou plusieurs populations ont besoin d&#39;être purifié qui ont différents niveaux d&#39;expression du marqueur de même surface. Par exemple, la purification de la zone marginale cellules B (CD21 + B220 Salut CD23 int / basse) et B folliculaire cellules (B220 + CD21 int / basse CD23 Salut) basé sur les niveaux d&#39;expression de CD21 et CD23. Une autre application croissante de la FACS est tri cellulaire unique permettant l&#39;analyse des cellules individuelles (3, 4). FACS est aussi couramment utilisé pour trier les cellules exprimant des protéines fluorescentes qui sont génétiquement exprimées, telles que le vert protéines protéine fluorescente marqués (5). Si une sorte stériles est effectuée, les cellules peuvent être cultivées. Cependant, la viabilité cellulaire et le rendement peut être compromise lors du tri. La viabilité peut être améliorée en utilisant une température dépendant des cellules optimales pour le tri et le traitement par les tubes de prélèvement immédiatement après avoir atteint la capacité. La récupération peut être augmentée en utilisant des tubes de prélèvement en polypropylène, la collecte de cellules triées dans le sérum rich media et des tubes de prélèvement inversant par intermittence, le maintien des tubes de prélèvement à une température optimale et la centrifugation des cellules triées pour ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). Le développement de l&#39;ultra haute vitesse trieurs a étendu la possibilité de l&#39;application du tri des flux dans les milieux cliniques. Les applications cliniques potentielles de la FACS comprennent la purification de cellules souches sanguines du sang humain à des fins thérapeutiques, les applications dans le traitement du cancer, le remplacement amniocentèse, tri des spermatozoïdes humains et les détections précoce de la maladie (6, 7). Pour la coloration multicolore, la sélection d&#39;anticorps est une étape critique et fluorochromes sont choisis en fonction du système de détection pour chaque instrument en particulier. Il ya un certain nombre de compagnies qui vendent des trieurs de cellules et de la configuration du laser varie en fonction des besoins des utilisateurs. Ainsi, on ne peut pas simplement utiliser les anticorps utilisés dans exactement les mêmes études publiées sans confirmer la compatibilité. Pour la sélection d&#39;anticorps optimal, on doit considérer le niveau d&#39;expression de la protéine à l&#39;étude. En général, les plus brillants disponibles anticorps marqués au fluorochrome doit être utilisé pour colorer les marqueurs de surface faiblement exprimés, tandis que fluorochromes DIM peut être utilisée pour la coloration des marqueurs de surface fortement exprimée (8). En outre, les anticorps doivent être choisis de telle manière que les chevauchements entre leurs spectres d&#39;émission est minime. Pour la coloration multicolore, il est extrêmement difficile de choisir un fluorochrome qui n&#39;ont pas de chevauchement spectral. Dans cette situation, la compensation est effectuée. La rémunération est mathématiquement nécessaire pour éliminer le chevauchement entre le spectre de fluorescence des émissions des fluorochromes différents qui est mesurable par les détecteurs (8-10). En d&#39;autres termes, le chevauchement de fluorescence d&#39;un fluorochrome est soustrait du spectre des émissions d&#39;un autre fluorochrome. Le calcul de la compensation requiert un contrôle sans tache et simple des contrôles positifs pour chaque fluorochrome utilisé pour une coloration multicolore (9, 10). La compensation peut être réalisée en utilisant des cellules ou des perles. Les perles sont faciles à colorer, avoir un signal robuste et offrent un moyen facile de préparer seul contrôle qui ont teinté les fluorophores même que les échantillons expérimentaux. Perles de rémunération sont particulièrement avantageux lorsque la protéine de surface cellulaire d&#39;intérêt est exprimé à un niveau bas et quand la population cellulaire d&#39;intérêt est de limiter dans la population cellulaire initiale de départ. Une fois que les anticorps ont été choisis, leur activité doit être optimisée en effectuant une analyse de titration. Ceci est particulièrement important si la machine FACS a lasers très puissants. L&#39;utilisation de concentrations suboptimales d&#39;anticorps coloration peut entraîner une mauvaise séparation de la population cellulaire désirée de la population cellulaire totale. L&#39;utilisation de concentrations élevées d&#39;anticorps augmente les chances pour antigène non spécifique coloration. Par conséquent titrage d&#39;anticorps permettant la sélection de la concentration en anticorps qui donne la luminosité maximale de la population positive et une coloration de fond minimal (8). FACS est maintenant une technique standard pour la purification des sous-populations de cellules. Il peut être utilisé pour séparer n&#39;importe quel type cellulaire dans lequel une suspension cellulaire unique peut être généré et les anticorps sont disponibles pour identifier la population cellulaire désirée. FACS est la méthode de choix quand highly populations de cellules pures sont nécessaires.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Des études expérimentales et cliniques ont souvent besoin hautement purifiée populations de cellules. FACS est une technique de choix pour purifier les populations de cellules de phénotype connu. Autres méthodes de purification en vrac comprennent panoramique déplétion complément, et séparation magnétique perle. Toutefois, FACS a plusieurs avantages sur les autres méthodes disponibles. FACS est la méthode préférée quand une pureté très élevée de la population désirée est nécessaire, lorsque la population de cellules cibles exprime un niveau très bas du marqueur identifiant ou lorsque les populations de cellules nécessitent une séparation basée sur la densité de marqueur différentiel. En outre, FACS est la seule technique de purification disponibles pour isoler les cellules basées sur la coloration interne ou l&#39;expression des protéines intracellulaires, comme un marqueur fluorescent protein génétiquement modifiés. FACS permet la purification des cellules individuelles basées sur la taille, la granularité et la fluorescence. Afin de purifier les cellules d&#39;intérêt, ils sont d&#39;abord colorées par fluorescence marqués d&#39;anticorps monoclonaux (mAb), qui reconnaissent des marqueurs de surface spécifiques sur la population de cellules désirée (1). La sélection négative des cellules non colorées est également possible. Purification de FACS nécessite un cytomètre en flux avec tri des capacités et le logiciel approprié. Pour FACS, les cellules en suspension sont transmises comme un flux de gouttelettes avec chacun contenant une seule cellule en face d&#39;un laser. Le système de détection par fluorescence détecte les cellules d&#39;intérêt basé sur des paramètres prédéterminés fluorescents des cellules. L&#39;instrument applique une charge à la goutte contenant une cellule d&#39;intérêt et d&#39;un système de déflexion électrostatique facilite la collecte des gouttelettes chargées dans des tubes de collecte approprié (2). Le succès de la coloration et de ce fait le tri dépend largement de la sélection des marqueurs d&#39;identification et le choix du MAB. Paramètres de tri peut être ajusté en fonction de l&#39;exigence de pureté et de rendement. Bien FACS nécessite un équipement spécialisé et la formation du personnel, c&#39;est la méthode de choix pour l&#39;isolement des populations de cellules hautement purifiées.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Pour de nombreuses études scientifiques nécessitant une analyse biologique et chimique des populations de cellules, les cellules doivent être dans un état de pureté élevé. Fluorescence tri cellulaire (FACS) est une méthode supérieure dans laquelle d&#39;obtenir des populations de cellules pures.

Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K vues.  BloodCenter of Wisconsin. Pour de nombreuses études scientifiques nécessitant une analyse biologique et chimique des populations de cellules, les cellules doivent être dans un état de pureté élevé. Fluorescence tri cellulaire (FACS) est une méthode supérieure dans laquelle d'obtenir des populations de cellules pures.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Recherche

Immunologie et infection

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Génération de cellules T spécifiques Multivirus pour prévenir / traiter les infections virales, après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...