저자는 초기 K562 aAPC 및 mIL21 퓨전 벡터를 만드는 그들의 작업에 로렌스 쿠퍼, Harjeet 싱, 그리고 렌카 Hurton 감사하고 싶습니다. 이 작품에 대한 자금은 UT MD 앤더슨 의사 과학 프로그램, 세인트 Baldrick의 재단, 그리고 프렌즈의 전설에 의해 제공되었다.

1. 버피 코트에서 PBMCs의 분리 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 leukapheresis에서 파생된 건강한 기증자 버피 코트를 샘플에서 Ficoll - Paque에 대한 낙관적인 밀도 원심 분리하여 얻을 수 있습니다. <ol><li> Ficoll - Paque 원심 분리는 사소한 수정 따라 제조 업체의 프로토콜로 이루어집니다. </li><li> 140 ML (일반 버피의 코팅 량이 40-70 ML합니다)의 최종 볼륨 혈액 은행 버피 코트를 정상 기증자에 PBS를 추가합니다. </li><li> 레이어 Ficoll - Paque (4 튜브) 15 ML에 버피의 외투 샘플 35 ML. </li><li> 브레이크없이 20 분 동안 400g의 원심 분리기. </li><li> Ficoll - Paque에서 PBMCs 복구 : 플라즈마 인터페이스를 Ficoll - Paque의 하단에있는 RBCs을 삭제하지 않습니다. </li><li> 10 분 400g 각 시간을 centrifuging, PBS로 PBMCs 세 번 씻으십시오. </li><li> PBMCs는 (제 4) RosetteSep에 의해 격리 수있는이 단계에서 NK 세포 확장 또는 NK 세포에 대한 직접 사용할 수 있습니다 </li><li> 남은 PBMCs는 액화 질소에 10 % DMSO를 포함 FBS에 냉동 수 있습니다. </li><li> Ficoll을 대기음 두 50 ML의 원심 관에 5 단계에서 RBCs를 수집, PBS (50 ML 표시 추가)로 세 번 씻어, 각 시간 RBC 계층의 맨 위에는 granulocytes를 제​​거 뜨는 감추고 대기음. </li><li> RBCs는 NK 세포의 RosetteSep  정화 (4 항 참조)에 즉시 사용 또는 4 알서버의 솔루션의 같은 볼륨에 저장할 수 있습니다 ° C 나중에 사용하기 위해 (RBCs 4 주 최대 저장할 수 있습니다.) </li></ol> 2. NK 셀 확장 NK 세포 확장이 PBMCs를 사용하거나 NK 세포를 정화 시작하실 수 있습니다. 확장에 사용 PBMCs의 금액이 세 주 확장의 끝에 원하는 NK 세포의 크기에 따라 다양 수 있습니다 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오. (참고 1 참조) 자극 하나 주 영 <ol><li> 확장 각 5x10 6 PBMCs, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 10x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. </li><li> 우편 조사, NK 세포 확장 미디어 (NKEM)에 PBS와 resuspend로 세포를 씻어. </li><li> 10x10 6 조사 K562 Cl9 T75 플라스크에 NKEM 40 ML에 mIL21 (1시 2분 비율)과 37 인큐베이터에 똑바로 놓으 ° C와 5% CO 2.와 종자 5x10 6 PBMCs </li></ol> 일 3과 5 <ol start="4"><li> 5 분 400g에 원심 분리하여 세포를 복구하고 신선한 NKEM으로 미디어의 절반을 교체 (전체 미디어 볼륨에 대한 신선한 IL2 추가)과 문화를 계속합니다. </li></ol> 자극이 일 6.25 <ol><li> 1 주일 끝에 문화에 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 </li><li> restimulated하는 각 5x10 6 셀, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 5x10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. </li><li> (참고 3 참조) 2.5x10 5 총 세포 / ML에서 NKEM의 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율)과 resuspend의 동일한 숫자를 추가합니다. </li><li> T75 flasks의 종자 세포 (플라스크 당 최대 50 ML)를. </li></ol> 10 12 일 <ol start="6"><li> 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM로 전체 미디어를 변경합니다. </li></ol> 일 14 <ol start="8"><li> 확장 2 주의 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5x10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 </li><li> 확장이 PBMCs에서 시작된 경우 NK 세포는 RosetteSep 정화 프로토콜 (제 IV 참조)를 사용하여 확장이 단계에서 정화 수 있습니다. 확장은 자극 3 진행 NK 세포를 정화로부터 시작되었습니다하십시오. </li><li> 정화는 NK 세포 (8 단계에서와 같이)의 순도를 확인 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 별도 5x10 5 세포를 설정하면. </li><li> 정화 NK 세포의 모든 (참고 4 참조)를 사용하여 자극 3 진행합니다. </li></ol> 자극 3 <ol><li> 휴대폰 번호에 따라 NKEM에서 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율) (참고 3 참조) Resuspend NK 세포. </li></ol> 17 19 일 <ol start="2"><li> 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM와 미디어를 변경합니다. </li></ol> 일 21 <ol start="4"><li> 확장 세 주 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. </li><li> 전체 NK 세포 phenotyping 항체 패널 유동세포계측법 분석을위한 1x10 6 세포를 (표 1 참조) 복구. </li><li> 나중에 사용하기 위해 유리병 당 5x10 7 세포의 최대 농도에서 10 % DMSO를 포함 FBS에서 세포를 고정. </li></ol> 3. NK 세포 세포 독성 분석 <ol><li> NKEM의 NK 세포와 씨앗의 유리병, PE하기 전에 하루 해동복구를 허용 세포 독성 분석을 rforming. </li><li> 하나의 타겟 세포 라인, 6x10 5 NK 세포 3x10 오 대상 세포를 사용하여 각 NK 세포 세포 독성 분석을 위해 (주 5 참조)가 필요합니다. </li><li> NKEM에 Calcein - AM (재고 1 DMSO에 MG / ML)을 (참고 6 참조) diluting하여 CAM - 미디어를 준비합니다. </li><li> (주 7 참조) CAM - 미디어 1 ML 10 6 타겟 세포를 Resuspend. </li><li> 가끔 잡고, 37 ° C에서 1 H에 대한 부화. </li><li> Resuspend NK의 1x10 6 셀 / ML에서 세포 및 U - 하단의 3 우물 각 NK 세포 현탁액의 200uL을 추가 96 - 웰 플레이트에 해당 to10 : 1 E : 그림 1에 표시된 T 비율. (주 8 참조) </li><li> &quot;최대&quot;를 제외한 모든 나머지 우물에 완전한 미디어 100uL을 추가합니다. </li><li> &quot;최대&quot;로 2% 트리톤의 100uL X - 100을 추가합니다. </li><li> 5 후속 E에 대한 NK 세포의 시리얼 dilutions를 수행합니다 : 세포의 100uL 때마다 전송하여 T 비율은 잘 섞는다. 마지막 우물 (0.3125:1의 T 비율 E)에서 100uL 폐기하십시오. </li><li> calcein 로딩 1 시간 후, 1200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 NKEM의 목표 세포를 씻으십시오. (참고 9 참조) </li><li> 1x10 5 셀 / ML에서 대상 세포와 resuspend를 다시 계산합니다. </li><li> (1x10 4 / 잘) 각 잘하는 대상 세포 100 μL를 추가합니다. 세포 접촉을 시작 100g 1 분 원심 분리기. </li><li> 37 품어 ° C, 5 % 4 시간 CO 2. </li><li> 균일 출시 calcein을 중지하기 위해서는 100 μL pipetter로 pipetting하여 부드럽게 문화를 혼합, 펠릿 세포 5 분 100g에 접시를 스핀 다운하여 거품을 피하기 위해 관리하는 새 접시에 뜨는 100 μL를 전송합니다. 미세 바늘을 사용하여 양식을 수있는 거품 팝. </li><li> 형광 플레이트 리더 (여기 필터 485 NM, 방사 필터 530 NM)를 사용하여 번호판을 읽어보십시오. 히프 읽기를 권장합니다. </li><li> X 100. - [/ (시험 자료 - 자연 릴리스) (자발적인 자료 최대 릴리스)] 공식에 따라 특정 용해 비율을 계산 </li></ol> 4. RosetteSep하여 NK 세포 정제 <ol><li> 50 ML 튜브 (PBMC 100:1 RBC)로, PBMCs 또는 확장 세포의에 RBCs의 100 배 초과를 가져가라. </li><li> 사용 신선한 RBCs 다음 단계로 바로 진행하거나 RBCs가 알서버의 솔루션에 저장된이라면 1,200 rpm으로 centrifuging, RBCs의 수를 계산하고 (100 배 초과) 2퍼센트 FBS와 세 번 보충 PBS로 RBCs의 양을 적절한 세척하는 경우 십분 때마다. </li><li> 단계 1.7 또는 PBS 단계에서 2.10에서 확장된 세포에서 PBMCs와 RBCs를 결합 + 2% FBS PBMCs 또는 확장 셀 5x10 7 당 1 ML의 마지막 볼륨. </li><li> RosetteSep의 1μL PBMCs 또는 확장 셀 1x10 6 회  인간 NK 세포 농축 칵테일을 추가합니다. </li><li> 잘 믹스하고 5 분마다 혼합 부드러운 20 분 동안 상온에서 알을 품다. </li><li> 같은 부드럽게 PBS + 2% FBS 믹스의 볼륨과 Ficoll - Paque 상단에 레이어를 추가합니다. </li><li> PBMC 분리에 대한 설명 Ficoll - Paque 원심 분리의 단계 (제 I)를 반복합니다. </li><li> 정화 후 복구 NK 세포를 카운트하고 북한 세포 순도 (8 단계)에 대한 유동세포계측법에 의해 phenotpying에 대한 5x105 세포를 따로 설정할 수 있습니다. </li></ol> 5. 노트 참고 1. NK 세포가 PBMCs에서 직접 확장 또는 RosetteSep  정화 NK 세포에서하실 수 있습니다. 우리는 유사한 확장 효율성을 지적했지만 어떤 장기 기증자가 확장 이전 RosetteSep로 어려움 정화의 결과로 매우 낮은 NK 세포 번호가있을 수 있습니다. 참고 2. 우리는 일상적 인 경우에는 3 번 CD에 들어 음수 및 CD16 또는 CD56 양성하는 것과 같은 NK 세포를 열거, 확장하는 동안 phenotyping에 대한 CD56 - FITC, CD16 - PE, 그리고 인 경우에는 3 번 CD - PE - Cy5를 사용합니다. 참고 3. 각 매체 변경하거나 자극에서, 2.5 × 10 5 / ML에 resuspend 세포는 확장의 최고 단계에 ML 당 또는 2 백만 이하 NK / PBMC 휴대폰 번호를 유지합니다. 이것은 영양분의 고갈을 방지하고 최대한의 확장과 생존을 달성하는 데 도움이됩니다. 참고 4. NK 확장 속도 stimulations 1 또는 냉동 수있는 세포의 2 부분의 끝에 기증에 의존하고 있으며, 일부는 실험이 필요에 따라 더욱 확대했습니다. 우리는 나중에 확장을위한 냉동 세포를 사용하여 좋은 성공을 있었다. 참고 5. 우리가 NKEM 및 세포 독성 분석을 설정하기위한 NKEM 4 ML에 resuspended 4x10 5 Calcein - AM 스테인드 대상 세포의 700 uls에 resuspended 7x10 5 NK 세포의 최소를 사용하는 것이 좋습니다 오류를위한 공간을 마련하도록하기 위해서. 경우 대상 세포에게 세포의 높은 볼륨에 (최대 6x10 5-6 ML)을 사용중인 미디어 분지의 크기에 따라 필요할 수 있습니다 시딩위한 멀티채널 피펫을 사용합니다. 또한 권장 NK 세포 숫자는 E에 대해 구체적으로 다음과 같습니다 T 비율이 높은 E를 사용, 프로토콜에 게재 : T 비율이 증가이에 따라 ML 당 NK 세포 숫자 (40:1 E 들어 예 : T 비율 사용 4x10 6 셀 / ML) 6 참고. 우리는 1:500, 1:400의 다음 dilutions를 사용하여 원하는 대상 세포 라인에 대한 예비 Calcein - AM 로딩 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 1:300, 1:200 1:100과 최대 및 자발적인 릴리스 사이의 최적의 차이를 달성하기 위해. 참고 7. 대상으로 자기편 세포주를 사용하여, 먼저 비 효소 세포 분리 버퍼를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. ADCC을 수행하는 경우, CAM - 미디어 대상 세포의 중복 튜브를 준비합니다. 참고 8 ADCC을 수행하는 경우, 10시 1분 E에 대응하는 세 우물에 동일한 NK 세포를 추가합니다. ADCC를위한 T. 추가 기증자에 대한 반복합니다. 추가 대상 세포에 대해 반복합니다. 참고 9. ADCC 실험을 수행하는 경우, calcein 로딩 45 분 후, 대상 세포에 대한 ADCC를 유도하는 특정 항체의 10ug를 추가합니다. 15 분 후에, 1,200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 완벽한 매체 목표 세포를 씻으십시오. Resuspend 1x10 5 셀 / ML에서 세포 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다. 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 확장이 계획하신대로 수행하면 시작 소재, 1x10 9 10 10 전지 (기증자 의존 다양성)에 전형적인 NK 세포 수율 범위로 5x106 PBMCs를 사용하여, 위에서 설명한. 그림은 북한 세포 배 확장을 보여줍니다 (N = 19) 원래 제품에있는 NK 세포에 비해 (평균 + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 확장된 NK 세포는 몇 가지 예외 (CD11b, CD160과 CD244)로 unexpanded 기본 NK 세포에 비해 각종 NK 세포 수용체를 표현한다. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 버피 코트에서 PBMCs 복구 의존 기증하고 300x10 800x10 6 6 범위 수 있습니다. PBMCs의 18 % - NK 세포는 2 %를 구성 수 있습니다. 확대 세포의 RosetteSep 정화 들어, 40~70%에서 하루에 순수 NK 세포 14 범위의 회복. 확장 및 정화의 추천 프로토콜에 따라 99 %의 NK 세포 순도가 기대할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 확장된 NK 세포는 neuroblastoma, AML, osteosarcoma 및 흑색증 (대표 AML 살인은 %가 특정 용해으로 표시)을 포함하여 종양 세포 라인의 범위에 대한 세포 독성을 증명하고있다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

NK 세포 확장과 활성화 미디어 (NKEM) <ul><li> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% 태아 소 혈청 (Gibco) </li><li> 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (Cellgro) </li><li> 1X L - 글루타민 (Gibco) <ul><li> 사용하기 전에 미디어를 소독 필터. </li></ul></li><li> 50 U / ML IL2 (Proleukin, 노바티스 백신 및 진단, 병원) <ul><li> - 200 μl / IU 주식의 희석. 미디어의 원하는 금액을 IL2 추가는 전에 각 시간을 사용합니다. </li></ul></li></ul> PBMC 및 NK 세포 격리 <ul><li> Ficoll - Paque (GE 헬스케어) </li><li> 알서버의 솔루션 (시그마) </li><li> RosetteSep 인간 NK 세포 농축 칵테일 (Stemcell 기술) </li></ul> NK 세포 세포 독성 분석 <ul><li> Calcein - AM (Invitrogen) <ul><li> 증권 솔루션은 50 μL aliquots에 냉동 1mg / ML, 상점에 있습니다. 세포 얼룩에 대해 원하는 희석을 달성하기 NKEM 미디어에 디졸브. </li></ul></li></ul> 항체 NK 세포 phenotyping에 사용되는 항체의 목록은 아래와 같거나 그 이상; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 항독소 </td><td> 테스트 당 볼륨 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 튜브 1 </td><td valign="top"> Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> 튜브 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD16 알렉사 647 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> 관 세 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 NKG2D APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D 시스템 Miltenyi Biotec R &amp; D 시스템 BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> 튜브 사 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD27 APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> 튜브 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM - 1) PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD160 Alexa647 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> 튜브 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE 인 경우에는 3 번 CD에 들어 PE - Cy5 CD197 (CCR7) APC 외과 버퍼 총 볼륨 </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

자연 킬러 (NK) 세포가 전염성 미생물 및 종양의 다양한 대한 면역 감시에 중요한 역할을한다. NK 세포와 체외에서 확장 기능의 제한 여부는 NK 세포 immunotherapy의 개발을 제한하고 있습니다. 여기 우리는 효율적으로 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로, 멤브레인 - 바운드 IL21을 표현하는 K562 세포를 사용하여 기능성 NK 세포의 생체내 예 방대한 수량을 확장하는 방법을 설명합니다. 최신 NK 세포 입양 요법은 T 세포 혹은 NK 세포의 긍정적인 선택의 고갈 다음 기증자의 정상 상태 leukapheresis 얻은 세포 제품을 활용했습니다. 이 제품은 일반적으로 하룻밤 사이에 IL - 2 활성화하고 다음 1 일 관리합니다. 때문에 주변 혈액 NK 세포의 낮은 주파수의 NK 세포의 상대적으로 작은 숫자는 임상 실험에 전달되었습니다. 체외에서 NK 세포를 증식하는 무능력은 최적의 임상 결과에 대한 충분한 세포 번호를 생성을위한 제한 요인을하고 있습니다. NK 세포의 일부 확장 (1~2주 이상의 50-10 배)이 높은 선량 IL - 2 혼자 2 일까지 달성될 수있다. autologous T 세포의 활성화는 지역 시토킨 3 출시를 통해 또 아마도, NK 세포 확장을 중재 수 있습니다. mesenchymal 기질이나 인공 항원 제시 세포 (aAPCs)로 지원 말초혈 및 코드 혈액 사 모두에서 NK 세포의 확장을 지원할 수 있습니다. 연합 NKp46와 항체 - 코팅 구슬로 CD2 인증은 현재 21일 약 100 배 확장의 결과, NK 세포 확장 (Miltenyi Biotec, 오번 CA)에 판매합니다. NK 세포를 aAPC - 확장 또는 활성화 사용하는 임상 실험이 진행, 상당한 확장을하지 않고 leukemic 세포 라인 최고급 및 활성화 NK 세포 CTV - 15을 사용 하나입니다. 두 번째 재판은 21일 6 건 490 배 확장을 달성, NK 세포 확장을위한 EBV - LCL을 활용합니다. 세 번째는 K562 기반 aAPC 21 일 이내에 277 배 의미 NK 확장을 달성 4 - 1BBL (CD137L) 및 막 - 바운드 IL - 15 (MIL - 15) 7과 transduced 사용합니다. NK 세포 K562 - 41BBL - mIL15를 사용하여 확대 있지만 aAPC가 unexpanded 북한 세포에 비해 체외 및 생체내 높은 세포 독성 있으며, ADCC에 참여, 자신의 증식이 노화 telomere 단축 8 귀속에 의해 제한됩니다. 최근에는 NK 세포의 350 배 확장은 K562 표현 미카, 4 1BBL와 IL15 9를 사용 보도했다. NK 세포 확장의 우리의 방법은 여기 21일에 평균 21,000 배 확대를 달성 노화하지 않고 NK 세포의 급속한 확산을 생산하고 설명했다.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

48.1K 조회수.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. 여기 우리는 효율적으로 확장하고 정화 인간 NK 세포의 큰 숫자를하고 기능을 평가하는 방법을 설명합니다.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

연구

면역학 및 감염병학

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.