המחברים מבקשים להודות לורנס קופר, Harjeet סינג, ואת לנקה Hurton עבור עבודתם ביצירת הראשונית K562 aAPC ו mIL21 וקטורים היתוך. מימון עבור עבודה זו סופק על ידי תוכנית MD Anderson UT רופא המדען, קרן Baldrick סנט, ואת אגדות Friendswood.

1. בידוד של PBMCs מן באפי Coat כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתקבלים על ידי צנטריפוגה צפיפות קליל על Ficoll-Paque מן בריא התורם באפי דגימות מעיל שהפיק leukapheresis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה Ficoll-Paque נעשה כפרוטוקול יצרן לכל עם שינויים קלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לתורם נורמלי הדם הבנק מעיל באפי לנפח סופי של 140 מ&quot;ל (אופייני נפח באפי המעיל הוא 40-70 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה 35 מ&quot;ל של המדגם מעיל באפי על 15 מ&quot;ל של Ficoll-Paque (4 צינורות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 במשך 20 דקות ללא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור PBMCs מן Ficoll-Paque: ממשק פלזמה, אין להשליך את RBCs בתחתית Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PBMCs שלוש פעמים עם PBS, centrifuging כל פעם 400 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBMCs ניתן להשתמש ישירות להרחבת התא NK בשלב זה או תאים NK יכול להיות מבודד על ידי RosetteSep (סעיף 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBMCs נותרת יכול להיות קפוא FBS DMSO המכיל 10% חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב Ficoll לאסוף את RBCs מן שלב 5 לשני שפופרת 50 מ&quot;ל צנטריפוגות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS (להוסיף 50 מ&quot;ל סימן), בכל פעם לשאוב ברפרוף supernatant העליון של שכבת RBC להסיר גרנולוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs ניתן להשתמש מיד לטיהור  RosetteSep בתאי NK (ראה סעיף 4) או לאחסן נפח שווה של הפתרון של Alsever ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר (RBCs ניתן לאחסן לכל היותר 4 שבועות). </li></ol> 2. NK הרחבת Cell הרחבת התא NK יכול להיות יזם באמצעות PBMCs או מטוהרים בתאי NK. כמות PBMCs המשמש להרחבת יכולים להיות מגוונים בהתאם לכמות התאים נ&quot;ח הרצוי בסוף הרחבה שלוש בשבוע, עיין בסעיף נציג תוצאות לקבלת פרטים. (ראה הערה 1) גירוי 1 יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 6 PBMCs 5x10 יורחב, לספור מקרינים 10x10 6 K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה פוסט, לשטוף את התאים עם PBS ו resuspend בהרחבת NK תא התקשורת (NKEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x10 Seed 6 PBMCs 10x10 עם 6 מוקרן K562 Cl9 mIL21 (יחס 01:02) ב 40 מ&quot;ל של NKEM בבקבוק T75 ולמקם אותו זקוף באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> ימים 3 ו 5 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 דקות 5 ולהחליף חצי התקשורת עם NKEM טרי (הוספת IL2 טרי נפח התקשורת כולו) ולהמשיך תרבות. </li></ol> גירוי 2 יום 7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בתרבית בסוף שבוע אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 6 תאים 5x10 להיות restimulated, לספור מקרינים 5x10 6 K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספר שווה של מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ו resuspend ב NKEM ב 2.5x10 5 תאים בסך הכל / מ&quot;ל (ראו הערה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים T75 צלוחיות (מקסימום 50 מ&quot;ל לכל בקבוק). </li></ol> יום 10 ו -12 <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה שלמה התקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3). </li></ol> יום 14 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום שבועיים של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההרחבה הייתה החל מ PBMCs התאים נ&quot;ח יכול להיות מטוהרים בשלב זה של התרחבות באמצעות פרוטוקול טיהור RosetteSep (עיין סעיף IV). אם הרחבה החלה מטוהרים מן התאים נ&quot;ח להמשיך גירוי 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיהור להפריש 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה לאמת טוהר של תאים נ&quot;ח (כמו שלב 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך גירוי 3 באמצעות כל התאים מטוהרים NK (ראה הערה 4). </li></ol> גירוי 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend נ&quot;ח תאים עם מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ב NKEM מבוסס על מספרים סלולריים (ראו הערה 3). </li></ol> 17 ימים ו - 19 <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3). </li></ol> יום 21 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום שלושה שבועות של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור 1x10 6 תאים לניתוח cytometry זרימה מלאה עבור פאנל NK phenotyping תא נוגדן (ראו טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת תאים FBS המכילה DMSO 10% בצפיפות מירבית של 5x10 7 תאים לכל בקבוקון לשימוש עתידי. </li></ol> 3. Cytotoxicity NK Cell Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי בקבוקון של תאים NK ואת הזרע NKEM, יום אחד לפני performing assay cytotoxicity כדי לאפשר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל assay cytotoxicity NK לתא המטרה באמצעות תא יחיד קו, 6x10 5 תאים NK ו 3x10 5 תאים היעד נדרשים (ראו הערה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CAM-Media ידי דילול Calcein-AM (מניות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב DMSO) ב NKEM (ראה הערה 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 10 6 תאים היעד של 1 מ&quot;ל CAM מדיה (ראה הערה 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור h 1 ב 37 ° C, עם רועד מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בתאי NK ב 1x10 6 תאים / mL ולהוסיף 200uL ההשעיה תא NK לכל אחד 3 הבארות של bottom-U-96 גם צלחת to10 המתאים: 1 E: היחס T שמוצג באיור 1. (ראה הערה 8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100uL של מדיה מלאה על כל בארות הנותרים מלבד &quot;מקסימום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100uL של 2% Triton X-100 של &quot;מקסימום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי של תאים NK עבור ה 5 הבאים: יחסי T על ידי העברת 100uL של תאים בכל פעם, ומערבבים היטב. בטל 100uL מבארות האחרון (ה &#39;: יחס של 0.3125:1 T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של טעינה calcein, לשטוף את התאים היעד NKEM פעמיים, centrifuging במשך 5 דקות ב 1200 סל&quot;ד. (ראה הערה 9) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור מחדש את התאים היעד resuspend ב 1x10 5 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של תאים היעד היטב כל (1x10 4 / טוב). צנטריפוגה 1 דקות ב 100 גרם ליזום קשר עם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את התרבות על ידי pipetting עם pipetter 100 μL מנת אחיד להשעות את calcein שוחררו, התפנית כלפי מטה על צלחת 100 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים והעברת 100 μL של supernatant כדי בצלחת חדש בטיפול, כדי למנוע בועות. פופ כל בועות כי עלול להיווצר באמצעות מחט דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הצלחת באמצעות קורא צלחת ניאון (מסנן עירור 485 ננומטר, פליטת לסנן 530 ננומטר). מומלץ לקרוא התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמוגה אחוז מסוים לפי הנוסחה [(שחרור-ספונטנית מבחן שחרור) / (שחרור מרבי - שחרור ספונטני)] x 100. </li></ol> 4. NK טיהור Cell ידי RosetteSep <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 100 של פי עודף של RBCs לזה של PBMCs או תאים מורחבת, לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל (100:1 RBC: PBMC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RBCs טריים באמצעות להמשיך ישירות לשלב הבא או אם RBCs אוחסנו פתרון של Alsever, לספור את מספר RBCs ולשטוף המתאים (100 עודף לקפל) כמות RBCs עם PBS בתוספת 2% FBS שלוש פעמים, centrifuging בסל&quot;ד 1200 במשך 10 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב RBCs עם PBMCs משלב 1.7 או תאים מורחבת משלב 2.10 ב PBS + 2% FBS לנפח סופי של 1 מ&quot;ל לכל 5x10 7 של PBMCs או תאים מורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1μL של RosetteSep  האדם העשרה NK תא קוקטייל לכל 1x10 6 של PBMCs או תאים מורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ערבוב עדין כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים נפח שווה של תערובת PBS FBS + 2% בעדינות שכבה על גבי Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים של צנטריפוגה Ficoll-Paque תיאר לבידוד PBMC (סעיף I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים נ&quot;ח התאושש לאחר טיהור להפריש 5x105 תאים phenotpying ידי cytometry זרימה על טוהר תא NK (שלב 8). </li></ol> 5. הערות הערה 1. בתאי NK ניתן להרחיב ישירות PBMCs, או RosetteSep  תאים מטוהרים NK. רשמנו לפנינו את יעילות הרחבה דומה, אך תורמים כמה יכול להיות נמוך מאוד מספרים תא NK וכתוצאה מכך טיהור קושי על ידי RosetteSep לפני התרחבות. הערה 2. אנו משתמשים באופן שגרתי CD56-FITC, CD16-PE, ו-PE-CD3 Cy5 עבור phenotyping במהלך התרחבות, מונה תאים NK לאלה אשר CD3-שלילי CD16-CD56 או חיובי. הערה 3. כל שינוי התקשורת או גירוי, תאים resuspend ב 2.5 x מ&quot;ל 10 / 5 לשמור PBMC / NK מספרים התא או מתחת 2 מיליון דולר מ&quot;ל בשלבי השיא של התרחבות. זה ימנע דלדול של חומרים מזינים לסייע בהשגת הרחבה הישרדות מירבית. הערה 4. שיעור ההתרחבות NK הוא התורם תלויה בסופו של גירויים 1 או 2 חלק מהתאים אפשר להקפיא חלק התרחב עוד יותר, בהתאם לצורך הניסוי. יש לנו הצלחה טובה באמצעות תאים קפואים הרחבות במועד מאוחר יותר. הערה 5. על מנת לאפשר מקום לטעויות אנו ממליצים להשתמש מינימום של 7x10 5 תאים NK resuspended ב 700 ULS של NKEM ו 5 4x10 Calcein-AM מוכתם היעד תאים resuspended ב 4 מ&quot;ל של NKEM עבור הקמת assay cytotoxicity. אם באמצעות פיפטה רב עבור זריעת התאים היעד כמויות גבוהות יותר של תאים (עד 6x10 5 מ&quot;ל 6) עשויים להידרש מבוסס על גודל מדיה אגן בשימוש. גם המספרים מומלץ תא NK הם במיוחד עבור E: יחסי T להראות בפרוטוקול, לשימוש E גבוה: יחסי T להגדילהתא NK מספרים לכל מ&quot;ל בהתאם (למשל עבור דואר 40:1: השימוש T יחס 4x10 6 תאים / מ&quot;ל) הערה 6. אנו ממליצים לבצע טיטרציה ראשונית Calcein-AM טעינת לקו היעד תא של בחירה, באמצעות דילולים הבאות של 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 ו - 1:100 להשיג אופטימלי ההבדל בין שחרור מקסימלי ספונטנית. הערה 7. כשמשתמשים קו תא חסיד כמטרה, תחילה להכין ההשעיה תא בודד באמצעות אי - האנזימטית חיץ ניתוק התא. אם ביצוע ADCC, להכין צינור כפולות של תאים היעד CAM מדיה. הערה 8 אם ביצוע ADCC, להוסיף לתאי NK אותו 3 בארות המתאים E 10:01:. T עבור ADCC. חזור לתורמים נוספים. חזור עבור תאים יעד נוספים. הערה 9. אם ביצוע ניסוי ADCC, לאחר 45 דקות של טעינה calcein, להוסיף 10ug של נוגדנים ספציפיים עבור גרימת ADCC נגד התאים היעד. לאחר 15 דקות, לשטוף תאים היעד בינוני מלא פעמיים, centrifuging 5 דקות ב 1200 סל&quot;ד. תאים Resuspend ב 5 תאים 1x10 / mL ולהמשיך לשלב הבא בפרוטוקול. 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כאשר הרחבת מבוצע לפי התוכנית שתוארה לעיל, באמצעות 5x106 PBMCs כחומר מוצא, אופייני התא NK התשואות נעות בין 1x10 אוקטובר 09-10 תאים (השתנות התורם תלויה). האיור מציג הרחבת התא NK לקפל (n = 19) בהשוואה לתאי NK נוכח המוצר המקורי (חציון + / - ברבעון). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. התאים מורחבת NK מבטאים שונים קולטני התא NK כי הם דומים לתאי NK מורחבת ראשוני עם כמה יוצאים מן הכלל (CD11b, CD160 ו CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. ההתאוששות PBMCs מן באפי המעיל הוא התורם תלויה יכול לנוע בין 6 ל 300x10 800x10 6. התאים עשויים NK מהווים 2% - 18% PBMCs. עבור טיהור RosetteSep של תאים מורחבת, התאוששות של תאים NK טהור ביום 14 נע בין 40-70%. על ידי ביצוע הפרוטוקול המומלץ של התרחבות וטיהור, טוהר תא NK של 99% ניתן לצפות. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. בתאי NK מורחבת הוכיחו cytotoxicity נגד מגוון של שורות תאים סרטניים ובהם נוירובלסטומה, AML, אוסטאוסרקומה ומלנומה (רצח נציג AML כפי שמוצג תמוגה אחוז מסוים).

<ol>
	<li>McKenna, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy:+a+six-year+single-institution+experience.">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li><li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children.">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li><li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications.">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li><li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering.">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li><li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56++natural+killer+cells.">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li><li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells.">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li><li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets:+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation.">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li><li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells.">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy.">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells.">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li><li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A,+4-1BB+ligand,+and+interleukin-15.">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

NK הרחבת התא ומדיה הפעלה (NKEM) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% עוברית שור סרום (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פניצילין / סטרפטומיצין (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x-L-גלוטמין (Gibco) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר מדיה לפני השימוש. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / mL IL2 (Proleukin, חיסונים נוברטיס אבחון, Inc) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - מדולל ממלאי IU / μl 200. הוסף IL2 לכמות הרצויה של התקשורת רק לפני השימוש בכל פעם. </li></ul></li></ul> PBMC ו NK תא בידוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alsever של פתרון (Sigma) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RosetteSep האדם העשרה NK תא קוקטייל (Stemcell טכנולוגיות) </li></ul> Cytotoxicity NK Cell Assay <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein-AM (Invitrogen) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הוא במלאי בחנות, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קפוא 50 aliquots μL. ממיסים בתקשורת NKEM להשיג דילול הרצוי עבור צביעת התא. </li></ul></li></ul> נוגדנים הרשימה של נוגדנים המשמשים phenotyping תא NK המפורטות בטבלה להלן; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> נוגדן </td><td> נפח לכל מבחן </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 אלכסה 647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tube 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D מערכות Miltenyi BIOTEC R &amp; D מערכות BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

טבעיים (NK) תאים הרוצח לשחק תפקיד חשוב במעקב החיסונית כנגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים גידולים זיהומיות. זמינות מוגבלת של תאים NK ואת היכולת להרחיב את במבחנה הגביל התפתחות של תא חיסוני NK. כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב את כמויות עצומות של תפקודי vivo לשעבר בתאי NK באמצעות K562 תאים להביע קרום הנכנס IL21, כתא אנטיגן הצגת מלאכותי (aAPC). טיפולים NK תא המאמצת עד כה נוצלו מוצר תא מתקבל על ידי leukapheresis היציב של התורם ואחריו דלדול בתאי T או סלקציה חיובית של תאים NK. המוצר מופעל בדרך כלל IL-2 לילה ומנוהלים אז למחרת 1. בשל שכיחות נמוכה של תאים NK בדם ההיקפי, מספר קטן יחסית של תאים NK הועברו בניסויים קליניים. חוסר היכולת להפיץ בתאי NK במבחנה כבר את הגורם המגביל להפקת מספרים תא מספקת תוצאה קלינית אופטימלית. יש הרחבה של תאים נ&quot;ח (פי 5-10 על 1-2 שבועות) יש להיות מושגת באמצעות מינון גבוה של IL-2 בלבד 2. הפעלה של תאים T עצמיים יכולים לתווך הרחבת התא NK, ככל הנראה גם באמצעות שחרור ציטוקין המקומי 3. תמיכה עם stroma mesenchymal או תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPCs) יכול לתמוך את התפשטות תאים NK מדם הן פריפריה דם טבורי 4. NKp46 משולב והפעלה CD2 ידי נוגדן חרוזים מצופים משווק כיום להרחבת התא NK (Miltenyi BIOTEC, אובורן CA), וכתוצאה מכך כ -100 הרחבה של פי 21 ימים. ניסויים קליניים תוך שימוש aAPC-מורחבת או המופעל בתאי NK נמצאים בעיצומם, אחד באמצעות שורת תאים leukemic CTV-1 אל התאים הממשלה להפעיל NK 5 ללא הרחבה משמעותית. במשפטו השני מנצל EBV-LCL להרחבת התא NK, השגת הרחבה 490 פי פירוש ב 21 ימים 6. השלישי מנצל aAPC K562 מבוססי transduced עם 4-1BBL (CD137L) ואת קרום הנכנס IL-15 (MIL-15) 7, אשר השיגה הרחבה נ&quot;ק ממוצע 277 של פי 21 ימים. אמנם, התאים נ&quot;ח הרחיבה באמצעות K562-41BBL-mIL15 aAPC הם ציטוטוקסיים מאוד במבחנה in vivo בהשוואה לתאי NK מורחבת, ולהשתתף ADCC, התרבות שלהם מוגבל על ידי ההזדקנות המיוחסת התקצרות הטלומרים 8. לאחרונה התרחבות של פי 350 של תאים NK נמסר באמצעות K562 מיקה להביע, 4-1BBL ו IL15 9. השיטה שלנו הרחבת התא NK המתוארים כאן מייצר התפשטות מהירה של תאים NK ללא הזדקנות השגת הרחבה 21,000 פי חציון 21 ימים.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells at JoVE.com

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

47.9K Views.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

Video: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...